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免疫化学方法测定动物组织中呋喃唑酮残留标示物

来源:武汉工业学院食品科学与工程学院 作者:未知 2009-7-25
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摘要: 【摘要】 以自制特异性抗体为核心试剂,建立了以苯甲醛为衍生试剂的呋喃唑酮残留标示物间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定法和间接竞争法确定ELISA方法最佳反应条件:抗原最佳包被浓度200 μg/L,抗体最佳稀释倍数1∶2。0 μg/kg AOZ,回收率55。测定20份不同组织的空白样品,方法的检出限为0。...


  【摘要】  以自制特异性抗体为核心试剂,建立了以苯甲醛为衍生试剂的呋喃唑酮残留标示物间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定法和间接竞争法确定ELISA方法最佳反应条件:抗原最佳包被浓度200 μg/L,抗体最佳稀释倍数1∶2.5×105,抗体与药物最佳工作配比40 μL∶60 μL,最佳竞争时间1 h。检出限为0.1 μg/L,检测范围0.1~25.6 μg/L,线性关系良好。在空白组织中(猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏、鱼肉)添加0.4、1.0和5.0 μg/kg AOZ,回收率55.8%~96.6%,相对标准偏差均小于20%。测定20份不同组织的空白样品,方法的检出限为0.4~0.5 μg/kg。以100 mg/kg呋喃唑酮饲喂动物,其组织样品同时经HPLC方法和本方法测定,数据表明本方法具有实际检出能力,测定结果与仪器方法的测定结果相近。通过与德国同类试剂盒比较实验表明,本方法的灵敏度、精密度、准确度接近于进口试剂盒水平,可用于动物可食性组织肝脏和肌肉中AOZ筛选。

  【关键词】  呋喃唑酮 32氨基222恶唑烷酮 免疫分析 动物组织 残留

  1  引言

  呋喃唑酮属于硝基呋喃类抗菌药,常用于防治畜禽肠道感染。据毒理学研究发现,呋喃唑酮具有较强的致癌、致畸、致突变作用[1,2],欧盟[3]、美国、中国等均禁止在畜禽生产中使用。但由于呋喃唑酮抗菌效果良好,仍有滥用现象,残留超标事件时有发生。因此开发灵敏高效的呋喃唑酮残留的检测方法具有重要意义。

  呋喃唑酮在体内很快代谢成32氨基222恶唑烷酮(AOZ),且存留较长时间,被视为残留标示物[4,5]。检测AOZ 时,通常先将AOZ从组织解离出来,再与衍生试剂22硝基苯甲醛生成32(22硝基苯亚甲基)2氨基222恶唑烷酮(NPAOZ),通过检测NPAOZ达到检测AOZ的目的。目前检测AOZ残留的方法有LC2UV[6]、LC2MS[7]和LC2MS2MS[8],我国检测呋喃唑酮标准主要有HPLC(SC/T 302222004)、HPLC2MS(GB/T 18932.2422005)。该类技术所需设备要求较高,不适合高通量样品筛选[9]。酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高、特异性好、成本低等特点,适于高通量样品筛选。德国Bio2pharm公司研发出AOZ酶联免疫试剂盒[10,11],其检测仍要将AOZ衍生成NPAOZ。目前,中国没有建立酶联免疫快速筛选方法,国内所用试剂盒主要依靠国外进口。因此,我国急需建立快速筛选呋喃唑酮的ELISA方法。本研究以本实验室制备的AOZ特异性抗体(特异捕获AOZ与苯甲醛的衍生物N2苯亚甲基232氨基222恶唑烷酮,PAOZ)为基础,建立了呋喃唑酮残留标示物ELISA方法,检测目标化合物为PAOZ,具有一定的创新性和重要的经济价值。

  2  实验部分

  2.1  试剂、仪器及实验动物

  AOZ、PAOZ、AOZ特异性抗体(华中农业大学国家兽药残留基准实验室);HRP2羊抗兔IgG(Pierce);卵清蛋白(Sigma公司);呋喃唑酮(山东金泰集团股份有限公司);苯甲醛(上海化学试剂公司);德国AOZ检测试剂盒(Bio2pharm);OasisTM MAX 固相萃取柱(Waters公司);其它试剂均为AR级。高效液相色谱仪(Agilent hp1100 series型);酶标仪(SUNRISE MagenllanCE 2.5型)。长大二元杂交去势仔猪,45日龄,体重(15.0±2.0)kg,购于华中农大试验猪场;鸡肉、鸡肝、鱼购于超市。

  2.2  实验方法

  2.2.1  间接竞争ELISA  用包被缓冲液将包被抗原(改造半抗原与卵清蛋白偶联物)稀释至适当的工作浓度,每孔100 μL,置于4 ℃ 12 h;洗涤后用1%的卵清蛋白37 ℃封闭1 h,加入系列浓度药物(PAOZ)标准品60 μL和药物抗体(特异捕获PAOZ)40 μL,37 ℃湿盒放置1 h,洗涤后每孔加入100 μL 1:10000的HRP2羊抗兔IgG,置37 ℃湿盒1 h,洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液,置于37 ℃显色10~15 min后,每孔加入50 μL的终止液,于450 nm测定各孔的吸光值[12]。

  2.2.2  ELISA最佳反应条件优化  采用方阵滴定法和间接竞争ELISA法优化抗原最佳包被浓度、抗体最佳工作浓度、抗体最佳工作量、最佳竞争时间[13,14]。在上述最佳条件下,将PAOZ母液稀释成0、0.1、0.4、1.6、6.4和25.6 μg/L系列浓度(数值实为AOZ浓度),按间接竞争ELISA方法进行测定,以PAOZ溶液浓度的对数为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制标准曲线,其中抑制率(%)=100B/B0,B0和B分别为零标准孔和含药物孔所对应的吸光值。

  2.2.3  样品衍生与提取  取1 g组织均质物,加入蒸馏水5 mL,1mol/L HCl 0.5 mL和0.01 mol/L的苯甲醛(甲醇溶液)100 μL,充分振荡,于37 ℃水浴锅孵育16 h。分别加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4、200 μL HClO4,剧烈振荡30 s,5000 r/min室温离心10 min。上清液移至另一容器,用5 mol/L NaOH溶液调pH至7.0,安装OasisTM MAX固相萃取柱,分别用3 mL甲醇和3 mL蒸馏水活化,加入上述样品,用3 mL 2%氨水溶液洗涤,3 mL甲醇洗脱,正压吹干,收集洗脱液。40 ℃氮气吹干,向收集瓶中加入PBS(pH 7.4)1 mL,振荡30 s,作为试样溶液[6],供ELISA方法测定。

  2.2.4  动物考核实验  取长大二元杂交去势健康仔猪15头,随机分为5组。第1组为空白对照组,其余4组饲喂含100 mg/kg的呋喃唑酮7 d,于停药0、7、14、28 d分别屠宰3头,空白对照组分别在停药0、7和28 d屠宰1头,采用ELISA法和HPLC法同时测定猪肝脏、肌肉中AOZ的含量。HPLC测定条件:色谱柱,ZORBAX XDB2C18,250 mm×4.6 mm;检测波长 255 nm;流动相:V(KH2PO4)∶V(乙腈)∶V(甲醇)=65∶30∶5。

  3  结果与讨论

  3.1  ELISA最佳反应条件

  方阵滴定初步确定抗原包被工作浓度为250 μg/L,抗体稀释比为1∶3.2×105。包被抗原以250 μg/L为中心浓度包被5个不同浓度,作间接竞争ELISA,结果(图1)显示包被抗原为200 μg/L时,抑制率下降最快,为抗原最佳包被浓度。抗体以3.0×105为中心浓度稀释成5个不同浓度,作间接竞争ELISA,结果显示抗体稀释比为1∶2.5×105时,抑制率下降最快,为抗体最佳工作浓度。设计4个抗体与药物的工作配比(60∶40、50∶50、40∶60、30∶70),作间接竞争ELISA,结果显示抗体与药物40 μL∶60 μL时,抑制率下降最快,为最佳工作配比。包被200 μg/L抗原,经5个不同时间(0.5、1.0 、1.5、2.0和3.0 h)竞争反应,结果表明,经过1 h的反应后,OD值趋向稳定,竞争反应达到平衡状态,为最佳竞争时间。

  图1  不同包被抗原浓度对竞争反应的影响(略)

  Fig.1  Influence of various concentration of coating antigen on competition reaction

  (□) 350 μg/L;(○) 300 μg/L; (△) 200 μg/L; (y) 150 μg/L; (ü) 250 μg/L; PAOZ: 32[N2phenyl2methylene]2amino222oxazolinone.

  3.2  标准曲线

  在ELISA最佳反应条件下绘制标准曲线,图2显示标准曲线在0.1~25.6 μg/L范围内,线性关系好,回归方程y=-30.367x+49.653, r= 0.9939,标准品最低检出限0.1μg/L, IC50达0.95 μg/L。结果表明本方法灵敏度高。

  图2  PAOZ标准曲线(略)

  Fig.2  Enzyme2linked immunosorbent assay(ELISA) standard curve for PAOZ

  3.3  方法的检出限、回收率与相对标准偏差

  以10个空白组织的测定浓度加上3倍标准差为组织中检出限[15]。测定20份空白样品结果见表1。猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝、鱼组织中的检出限均低于0.5 μg/kg,欧盟规定AOZ在可食性组织存在最大量不得超过1.0 μg/kg,本ELISA方法的灵敏度满足欧盟官方规定,可以准确筛选组织中AOZ残留。

  将1 g/L AOZ母液稀释成适当浓度,添加到1g匀浆组织中使其终浓度为0.4、1.0和5.0 μg/kg,每个浓度3个平行,重复5个批次,间接竞争ELISA测定样品中AOZ浓度,计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

  回收率结果(表1)显示各组织中AOZ回收率在55.8%~96.6%之间,批间变异系数均<20%,在低浓度(0.4 μg/kg)和中浓度(1.0 μg/kg)方法的准确度和精密度符合兽药残留筛选分析方法的要求,而高浓度(5.0 μg/kg)回收率最低达55.8%,提示本方法样品提取效率不高,有待进一步优化。

  表1  检出限、空白组织提取回收率和相对标准偏差(略)

  Table 1  Result of  LOD, recoveries and coefficient of 32amino222oxazolidone(AOZ) in blank tissues

  LOD: 检出限(limit of detection)=+3 SD。3.4  假阳性率和假阴性率

  分别测定20个空白猪肉样品,20个添加AOZ猪肉样品(浓度为0. 5和1.0 μg/kg),评价ELISA方法假阳性率和假阴性率。

  图3  空白猪肉组织、添加0.5和1.0 μg/kg猪肉样品的测定浓度(略)

  Fig.3  Concentration of blank swine muscle, 0. 5 μg/kg and 1.0 μg/kg spiked swine muscle

  由图3可知,20个空白猪肉样品测定值均低于检出限(0.4 μg/kg)以下,而添加0.5和1.0 μg/kg的样品,除了一个样品外,其余样品均高于检出限。因此,本方法未出现假阳性结果,在0.5 μg/kg浓度,假阴性率为5%,在1.0 μg/kg浓度,未出现假阴性结果,符合我国筛选方法假阴性率不得超过5%的规定。结果表明,本方法能准确区分阴性样品和1.0 μg/kg的阳性样品。

  3.5  动物实验

  空白肝脏与停药28 d肝脏组织色谱图见图4。动物试验测定结果(表2)显示ELISA方法测定肝脏、肌肉中AOZ含量与HPLC相近,证明了本方法具有检测实际样品的能力,可特异性的区分加药组和空白对照组,测定结果准确、可靠,可用于食品动物可食性组织肝脏、肌肉中AOZ残留检测。

  3.6  同类试剂盒比较

  参考欧盟兽药残留分析标准实验室评价ELISA试剂盒的质量参数[15]。本ELISA方法和德国试剂盒检测能力相当,检出限均为0.1 μg/L。在空白猪肝、猪肉样品中添加0.4、1 .0和5.0 μg/kg的AOZ,同一份样品分别用本ELISA方法和德国试剂盒测定,结果见表3。本方法回收率(61.0%~92.5%)接近德国试剂盒(75.2%~127.5%)水平,均属于正常波动范围。但ELISA方法在高浓度回收率(61.0%)低于德国试剂盒水平(76.4%),其原因可能是本方法的样品提取效率低于德国试剂盒样品提取效率,因此有必要对本方法样品提取程序作进一步的探索。

  图4  空白猪肝脏(A)和肝脏样品(B)色谱图(略)

  Fig.4  Chromatograms of blank swine liver (A) and liver sample (B)

  表2  饲喂呋喃唑酮猪肝脏和肌肉中AOZ含量的测定结果(μg/kg,n=3)(略)

  Table 2  Detection of AOZ in liver and muscle tissues from pigestreated with feed containing 100 mg/kg furazolidone(μg/kg, n=3)

  “ND”: 表示未检测出(no detection); HPLC的检出限(LOD of HPLC used in this study) 5μg/kg。

  表3  同类试剂盒回收率比较(略)

  Table 3  Comparison of recoveries of two kits

  -:未计算(no calculation)。

  【参考文献】

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