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高效毛细管电泳测定赤土茯苓中的赤土茯苓苷

来源:东方医药网 作者:未知 2008-3-21
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摘要: 【摘要】 目的:建立高效毛细管电泳测定赤土茯苓中赤土茯苓苷的方法。方法:采用胶束电动毛细管电泳法。结果:赤土茯苓苷在0.399~39.9μg/mL 范围内,浓度与峰面积呈良好的线形关系,r=0.9999。测得赤土茯苓中赤土茯苓苷的含量为0.63% 。...


【摘要】 目的:建立高效毛细管电泳测定赤土茯苓中赤土茯苓苷的方法。方法:采用胶束电动毛细管电泳法。运行缓冲液为44mmol/L1硼酸-19mmol/L 十二烷基硫酸钠(SDS)-6% 甲醇(pH8.22);操作电压20kV;检测波长208nm。结果:赤土茯苓苷在0.399~39.9μg/mL 范围内,浓度与峰面积呈良好的线形关系,r=0.9999。平均加样回收率为100.58% 。测得赤土茯苓中赤土茯苓苷的含量为0.63% 。结论:本法简便、快速、准确、灵敏,可用于赤土茯苓药材及制剂的含量测定及质量控制。
    土茯苓为百合科菝葜属植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb)的干燥根茎。《本革纲目》始称“土茯苓有赤白两种,药用者白者良”,系对传统上中医用作解毒、除湿、利关节药而言。我们从赤土茯苓中提取、分离并鉴定出一单体黄酮苷类有效成分赤土茯苓苷(smiglabrin,Smi),研究并发现了Smi对缺血心肌的保护作用和抗脂质过氧化作用。本研究应用高效毛细管电泳(HPCE)之胶束电动毛细管电泳法(MECC)测定赤土茯苓中Smi含量,以期为赤土茯苓药材及其制剂的质量控制提供快速、简便的方法和依据。
    仪器与试药
    Biofocus Capillary Electrophoresis System 3000型毛细管电泳仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA),紫外检测器;可装卸毛细管电泳柱套(Bio-Rad);未涂层熔硅弹性石英毛细管柱(Bio-rad),50μm (ID)×50cm,有效长度为柱长减去4.5cm;DELL OptiPlex GX110型微机;Biofocus op-erating software(Version 6.0)。Smi对照品(本室提取、分离、鉴定,纯度99% 以上) ;赤土茯苓(广东高要),实验用粉末过60目筛;甲醇为色谱纯;十二烷基硫酸钠(SDS,BDH Chemical Ltd.Poole England),其他试剂均为AR 级。
    方法与结果
    1 毛细管柱的处理
    1.1 新毛细管柱的预处理 开机后依次用0.5mol/L NaOH 冲洗20min,0.1mol/L NaOH 冲洗10min,超滤水冲洗10min,氮气吹干,备用。1.2 运行毛细管柱的处理 每次开机后依次用0.1mol/L NaOH冲洗10min,超滤水冲洗10min,运行缓冲液平衡20min;两样品测定间隔用运行缓冲液冲洗2min;测定样品完毕后依次用0.1mol/LNaOH冲洗2min,超滤水冲洗2min,氮气吹干,备用。
    2 测定条件
    根据Smi的化学结构及分子特性,首选了MECC。运行缓冲液为44mmol/L 硼酸-19mmol/L十二烷基硫酸钠(SDS)-6% 甲醇(pH 8.22);操作电压为20kV,极性由正到负,检测波长为208nm,柱温20℃ ,压力进样137.89kPa(20psi*sec),运行缓冲液和样品测试液均经0.45μm 滤膜过滤,进样前离心脱气。
    3 对照品储备液的制备
    精密称取55℃ 真空干燥至恒重的Smi对照品0.0399g,置50mL量瓶中,加80% 甲醇溶解并定容,即得39.9/mL 对照品储备液,0-4℃保存备用。4 标准曲线的制备精密吸取Smi对照品储备液一定量,用超滤水稀释成0.399,0.798,1.596,2.396,3.192,3.990,4.788,5.586,6.384,7.182,7.980,15.96,23.94,31.92和39.90μg/mL的浓度梯度对照品液。在“2项”的运行条件下,自动连续进样。以浓度(C,g·mL-1)对峰面积(A)进行线性回归,得回归方程:A =26 581.66C-7 916.46,r=0.9999。实验表明,Smi含量在0.399~39.9μg/mL范围内C与A 呈良好线性关系。
    5 精密度考察
    取浓度为5.0000和10.0000μg/mL的对照品溶液,在“2项”的运行条件下,日内每隔2h进样一次,日间每天进样一次,共测5次,测定峰面积和峰迁移时间,计算日内、日间RSD值。
    6 回收率实验精密吸取已知浓度的供试液(3.1832μg/mL)250μL,精密定量加入Smi对照品溶液(39.9μg/mL )50μL,照供试液的制备及测定方法制备并测定。
    7 供试液的制备与测定
    取赤土茯苓干燥粉末约50mg,共5份,精密称定,分别置10mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,超声40min,冷却,补充挥发的溶剂,离心,精密吸取上清液1mL于10mL 量瓶中,加超滤水至刻度。用0.45μm滤膜过滤后,在“2项”运行条件下进样,测定HPCE图谱。根据HPCE谱图积分所得峰面积,按标准曲线回归方程计算Smi含量,结果显示,赤土茯苓中Smi的平均含量为0.63% ,RSD=0.76% 。
    讨 论
    1 电泳模式的选择
MECC除了能分离离子化合物以外,还能分离不带电荷的中性化合物,Smi本身为弱极性近中性化合物,故选择MECC模式。
    2 运行缓冲液的优化
    2.1 缓冲体系的选择按照常规MECC方法,考察了硼砂-SDS、硼酸-SDS以及不同配比的磷酸盐一SDS缓冲体系,实验表明,硼酸-SDS缓冲体系分离度好。
    2.2 pH值优化本研究考察了在pH7~9范围内缓冲液的不同pH 值对Smi峰形、迁移时间及分离度的影响。当运行缓冲液pH 为8.22时,Smi峰形好、分离度好。实验表明,当缓冲液浓度不变时,随着pH值增加,样品表面负电荷增加,受阳极的吸引力也增加,其迁移时间增加,但当pH 值过大时,由于碱性增强,石英毛细管的内壁表面积易受碱的损伤,重复性差;而pH 值过小时,峰形及分离度均变差。
    2.3 缓冲液浓度 研究硼酸、甲醇和SDS三者不同浓度配比对分离效果的影响,进行了四因素、三水平L9(3 )正交试验,结果发现本研究采用的缓冲体系44mmol/L硼酸-19mmol/L SDS-6% 甲醇(pH8.22)的分离效果最佳。甲醇在缓冲体系中起着有机添加剂的作用,在低浓度时,有助于Smi峰与其他峰的分开,峰形较好;在较高浓度时,能明显增加迁移时间。一定浓度的甲醇有助于稳定电渗流,提高分离测定的重现性,短链醇如甲醇等在低浓度时降低临界胶束浓度(CMC),增强胶束形成;高浓度时,增加CMC,阻碍胶束形成。
    2.4 电压的选择实验中比较了运行电压10,15,18,20,22,25kV 对Smi分离效果的影响。升高运行电压可以加快分析速度,一定范围内提高电泳分离效能。当电压升高到25kV 时,峰迁移速度过快,分离度下降;当操作电压降低到10kV 时,迁移时间过长。考虑到仪器寿命、分离度及迁移时间等综合因素,本实验选择操作电压为20kV。
    综上所述,利用HPCE测定赤土茯苓中Smi含量,具有样品处理简单、操作简便、分析快速、灵敏度高等特点,适用于赤土茯苓药材及其制剂的含量测定及质量控制,也可用于Smi体内药物浓度分析和药动学研究。

[ 参考文 献 ]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2000年版.北京:化学工业出版社,2000.一部.15.
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[4] 李玉琪,李玉莲,张文敏,等.荧光分光光度法测定土茯苓中的赤土茯苓苷[J].中国新药杂志,2001,10(1):40—41.
[5] 邓延倬,何金兰.高效毛细管电泳[M ].北京:科学出版社。1996.115-135.


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