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RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1及Rb1含量

来源:药物分析杂志 作者:张园园,陈晓辉,毕开顺 2007-5-18
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摘要: 摘要:目的:建立清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1、HPLC含量测定方法。人参皂苷Rg1的流动相为乙腈-0。2mL/min,人参皂苷Rb1的流动相为乙腈-0。结果:该法人参皂苷Rg1平均回收率为100。...


摘要:目的:建立清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1、HPLC含量测定方法。方法:采用YWG-Cl8色谱柱(250 mm×4.6mm,10μm),检测波长:203nm。人参皂苷Rg1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(21:79),流速:1.2mL/min,人参皂苷Rb1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(31:69),流速:0.9mL/min。结果:该法人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD=1.16%(n=5)。人参皂苷Rb1的平均回收率为99.32%,BSD=2.52%(n=5)。结论:本法操作简便、准确,可作为清脑宣窍方有效部位的质量控制方法之一。
关键词:清脑宣窍方;人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1;RP-HPLC;含量测定
清脑宣窍方为现代名中医经验方,由栀子、三七等中药组成,经临床实践证明对于缺血性脑中风具有良好的疗效。我们运用复方有效部位研究思路与方法,对清脑宣窍方治疗脑中风的有效部位进行了分离富集,且根据复方有效部位及其主要化学成分的研究分析,确定以复方有效部位中总皂苷、总环烯醚萜苷以及主要成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rbl、栀子苷的含量,来有效控制清脑宣窍方有效部位的内在质量。我们建立了人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的反相高效液相色谱测定方法,并运用于测定该方有效部位样品及其药材中的人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的含量,为该方有效部位质量标准的建立和控制提供依据。
1 仪器与材料
Waters高效液相色谱系统(Waters 600 HPLC Pump,Waters 2487紫外检测器,Minnium32色谱工作站);MZITIFTR-AE240型电子分析天平,CX-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。索氏提取器。
对照品人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1,购自中国药品生物制品检定所(批号分别为:0703-200120,704-200115)。
栀子、三七药材均购自安国药材市场,经北京中医药大学中药学院生药系刘春生副教授鉴定为三七Pananx notoginseng (Burk).F.H.Chen、栀子GaMe-niajasminoides Ellis.。乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 人参皂苷Rg1的色谱条件
YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(21:79);流速:1.2mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rg1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.1.2 人参皂苷Rb1的色谱条件
YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(31:69);流速:0.9mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rb1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。

2.2 对照品溶液的制备
精密称定人参皂苷Rgl对照品6.20mg置于50mL量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度(浓度为0.124g/L),摇匀,作为人参皂苷Rg1对照品溶液。
精密称定人参皂苷Rb1对照品4.63mg置于25mL量瓶中,用30%乙溶液稀释至刻度(浓度为0.185g/L),摇匀,作为人参皂苷Rb1对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 有效部位样品溶液的制备
取有效部位约15mg,精密称定,置10mL量瓶中,加入30%乙醇,超声处理后,稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL上反相C18层析柱(内径1cm,填料为1g),先用35%甲醇溶液洗脱25mL,弃去;再以甲醇洗脱50mL,蒸干,甲醇超声溶解并定容至2mL容量瓶中,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。
2.3.2 药材供试品溶液的制备
分别称取3种不同产地三七药材各3份,每份约0.5 g,置索氏提取器中,加乙醚适量加热回流提取1h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,置索氏提取器中加甲醇适量,加热提取至甲醇无色,取甲醇提取液,挥干,残渣加甲醇溶解转移至25mL容量瓶中,定容。另取2mL转移至10mL容量瓶中,定容、摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为三七药材供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备
按照处方比例称取除三七外其他药材适量,按照有效部位的工艺制得阴性样品,再按2.3.1项下方法制备阴性样品溶液。
2.5 线性关系的考察
分别精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液(浓度为0.124g/L)2.0,4.0,8.0,12.0,16.0μL及人参皂苷Rbl对照品溶液(浓度为0.185g/L)4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μL,注入高效液相色谱仪,分别按上述色谱条件,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得人参皂苷Rgl回归方程为Y=301733X一3220.2,r=0.9999(n=5)。得人参皂苷Rbl回归方程为Y=244308X一8563.1,r=0.9998(n=5)。结果表明,人参皂苷Rgl在0.248~1.984μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系,人参皂苷Rbl在0.760~3.70μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度实验
精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液和人参皂苷Rbl对照品溶液各10μL,分别连续进样5次,测得人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.28%。人参皂苷Rbl峰面积的RSD为0.65%,表明方法的精密度良好。
2.7 稳定性实验
取有效部位样品约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。精密吸取有效部位样品溶液10μL,分别在制备后0、4、8、12、24 h进样,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积,计算峰面积RSD分别为0.91%及1.16%,表明样品溶液在1d内稳定。
2.8 重现性实验
精密称取同一批有效部位样品5份(约15mg),按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,进样,测得人参皂苷Rgl平均含量为5.88%,RSD为0.88%,人参皂苷Rbl平均含量为6.72%,RSD为1.76%,表明方法重现性良好。
2.9 回收率实验
称取已知含量的有效部位样品5份,每份约7.5mg,精密称定,置10mL量瓶中,分别定量加入0.124g/L人参皂苷Rg1对照品溶液3.2 mL及0.185g/L人参皂苷Rb1对照品溶液3mL,加入30%乙醇,以下按有效部位样品溶液的制备项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,注入液相色谱仪,依法测定,计算人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD为1.16%。人参皂苷Rb1平均回收率为99.52%,RSD为2.32%。
2.10 样品含量测定
2.10.1 有效部位样品含量测定
取3批有效部位样品各3份,每份约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rb1及人参皂苷对照品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,外标一点法测定含量。
2.10.2 三七药材样品含量测定
精密称取3批不同药材市场三七药材样品各3份,按三七药材样品项下制备,再分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品溶液10μL,外标一点法测定含量。
3 讨论
在对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1进行含量测定时,栀子成分对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1色谱峰有干扰,本论文建立了反相柱层析预处理方法,可以消除栀子成分的干扰,获得很好的分离。在使用YWG-C18色谱柱和紫外检测器的情况下,用梯度洗脱同时测定人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1时,基线向上漂移,导致较大误差,且分离时间较长,故使用两种色谱条件进行分别测定,可得到很好的结果。
参考文献
1 梁吉春,石任兵,刘斌,等.银翘散研究方法的新探讨.北京中医药大学学报,1999,22(1):37~38
2 陈萍,韦强.复方益血胶囊中人参皂苷Rg1定量分析方法研究.中国药科大学学报,20O3,34(1):35—37

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