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HPLC法测定马钱子及其制剂中士的宁与马钱子碱的含量

来源:禾工科仪 作者:佚名 2007-5-18
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摘要: 摘要 报道了采用HPLC法测定马钱子及其制剂中士的宁与马钱子碱的含量。色谱填料为硅胶(3 μm), 流动相为正己烷—二氯甲烷—甲醇—浓氨试液(47。关键词:士的宁马钱子碱马钱子马钱子散九分散高效液相色谱法 士的宁与马钱子碱为马钱子中主要有效且有毒成分, 必须严格控制其含量。中国药典(1995年版)收载的马钱子项下含量测定......


摘要  

           报道了采用HPLC法测定马钱子及其制剂中士的宁与马钱子碱的含量。色谱填料为硅胶(3 μm), 流动相为正己烷—二氯甲烷—甲醇—浓氨试液(47.5∶47.5∶5∶0.35), 检测波长为254 nm。实验结果表明,  该方法简便、准确,灵敏度高,重现性好。

关键词:士的宁 马钱子碱 马钱子 马钱子散 九分散 高效液相色谱法


            士的宁与马钱子碱为马钱子中主要有效且有毒成分, 必须严格控制其含量。中国药典(1995年版)收载的马钱子项下含量测定方法系计算分光光度法[1], 其制剂九分散与马钱子散项下则采用薄层扫描法测定士的宁的含量[2], 薄层扫描法在中药检验中应用比较普遍, 但重现性较差。采用HPLC法测定马钱子中士的宁的含量也有文献报道[3~5],但大多采用反相HPLC法。实验中发现,采用反相HPLC法测定士的宁与马钱子碱的含量,其色谱峰拖尾严重,分析分离时间长。为了更好地控制马钱子及其制剂中士的宁与马钱子碱的含量,统一药典收载的马钱子及其制剂的含量测定方法,本文采用正相HPLC法测定了马钱子、九分散及马钱子散中士的宁与马钱子碱的含量。


            1 仪器与试药


            LC-3A高效输液泵(日本岛津),SP100紫外检测器(美国光谱物理公司),C-R1B数据处理机(日本岛津);LC-10AD高压输液泵,SPD-M10A二极管阵列检测器,CLASS-10A色谱工作站(日本岛津);士的宁、马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所);二氯甲烷、正己烷等试剂均为分析纯;马钱子、马钱子散(山东东阿阿胶厂);
            九分散(北京同仁堂制药厂)。


            2 实验方法与结果
            2.1 色谱条件 色谱柱:Platinum silica(Alltech 3 μm,4.6mm×150 mm),流动相:正己烷—
            二氯甲烷—甲醇—浓氨试液(47.5∶47.5∶5∶0.35),流速:1.2 mL/min,检测波长:254 nm,AUFS:0.005。
            图1 分离色谱图
            1.士的宁 2.马钱子碱


            2.2 方法学考察
            2.2.1 最小测定量 精密吸取混合对照品溶液(士的宁: 0.1048 mg/mL,马钱子碱:0.1336 mg/mL)1.0、1.5 μL,在AUFS 0.002条件下, 重复进样,结果峰面积积分值的RSD分别为:士的宁2.4 %(1.0 μL,n=6),1.76  %(1.5 μL,n=5);马钱子碱 2.36 %(1.0 μL,n=6),0.89 %(1.5 μL,n=5)。参照文献[6],重复进样测定峰面积积分值,以峰面积积分值的RSD<2 %的进样量作为最小测定量,确定士的宁最小测定量为0.16 μg,马钱子碱最小测定量为0.20 μg。


            2.2.2 色谱峰纯度检测 将士的宁、马钱子碱混合对照品及各供试品溶液注入液相色谱仪,应用二极管阵列检测器和色谱工作站测得样品色谱中士的宁与马钱子碱的色谱峰峰纯度系数均大于0.999。


            2.2.3 色谱峰光谱一致性检测 应用二极管阵列检测器和色谱工作站,测得供试品中士的宁及马钱子碱色谱峰与士的宁及马钱子碱对照品色谱峰的吸收光谱(图2)相关系数分别为:士的宁1.0,马钱子碱1.0。
            图2 色谱峰的光谱吸收图


            1.马钱子碱对照品 2.士的宁对照品
            3.马钱子样品中马钱子碱 4.马钱子样品中士的宁
            2.2.4     线性关系 精密称取士的宁与马钱子碱对照品各适量,加醋酸乙酯制成每1 mL含士的宁0.4 mg、含马钱子碱 0.3
            mg的混合溶液,作为混合对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5、6、7、8 μL,
            注入液相色谱仪,测定其峰面积积分值。以进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线。士的宁与马钱子碱回归方程分别为:
            Y=712.857+106382.977X r=0.9999
            Y=-92.768+58045.104X r=0.9999


            2.2.5 精密度测定 精密吸取上述对照品溶液5 μL,注入液相色谱仪,重复注入6次,计算RSD分别为:士的宁0.40 %, 马钱子碱0.67 %。


            2.2.6 重现性实验 精密称取马钱子细粉约0.5 g,共取5份,按“样品测定”项下方?法提?取?、?测?定,结果RSD分别为:士的宁1.96 %,马钱子碱2.06 %。


            2.2.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的马钱子、马钱子散样品各0.25 g、九分散0.5  g,各取5份,分别加入含士的宁与马钱子碱对照品适量的氯仿溶液25 mL及浓氨试液1 mL,按“样品测定”项下方法提取、测定,计算回收率


            2.2.8 空白实验 按马钱子散和九分散的处方比例,取除去马钱子的其它药味混合,制成两者的阴性对照样品,按“样品测定”项下方法提取、测定,结果两阴性对照液在马钱子碱和士的宁相应的位置上,均无吸收峰。

            2.3 样品测定 精密称取马钱子、马钱子散样品各0.5 g、九分散1 g,置具塞锥形瓶中,精密加氯仿25 mL及浓氨试液1 mL,轻轻摇匀,称重,室温放置24 h,再称重,补足损失的氯仿量,摇匀,滤过,精密量取滤液10 mL,置分液漏斗中, 用硫酸溶液(3→100)提取5次,每次15 mL,合并硫酸提取液,用浓氨试液调节pH至8~9,用氯仿提取5次,每次20 mL,合并氯仿提取液,蒸干,残渣加醋酸乙酯溶解并定容至5 mL量瓶中,摇匀,用0.5 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。精密吸取马钱子、马钱子散供试品溶液2 μL,九分散供试品溶液8 μL与混合对照品溶液4 μL,注入液相色谱仪,测定,按外标一点法计算各样品中士的宁与马钱子碱的含量。


            3 小结与讨论
            3.1 关于样品提取问题,曾对超声处理30 min与浸泡24 h、浸泡过夜提取法进行比较,结果样品超声处理30 min,其含量远远低于浸泡24 h的含量,且杂质多,而浸泡过夜的含量比浸泡24 h的含量稍有偏低,为了确保样品提取完全,规定样品浸泡24 h后,再进行提取。


            3.2 在配制流动相时,可先将二氯甲烷与正己烷按比例配好后,再与甲醇、浓氨试液按95∶5∶0.35的比例配制,如按此比例配制的流动相出峰时间不合适,可调节二氯甲烷与正己烷的比例,色谱峰出峰太慢,可加大二氯甲烷的量,色谱峰出峰太快,则加大正己烷的量。


            3.3 为比较本法与药典法测定的差异,分别对马钱子、马钱子散、九分散样品中士的宁的含量进行了对比测定(结果见表2)。从测定结果看,马钱子采用本法比采用药典法测定结果低,这主要是药典采用计算分光光度法,虽在计算公式中扣除了马钱子碱成分,但其它含量较低的生物碱成分,在不经色谱分离的方法中仍可能为干扰成分。而马钱子散和九分散采用本法与药典法薄层扫描法结果基本一致,但薄层扫描法精密度较差。本法的建立为新版药典马钱子及其制剂中士的宁含量方法的修订提供了实验依据


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