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大鼠肝微粒体温孵体系中

来源:中国色谱网 作者:姚庆强王琰杨树民王慕邹 2007-5-18
336*280 ads

摘要: 摘要:目的:建立黄皮酰胺及其代谢产物的HPLC-ESI-MS在线检测分析方法,并对未分离得到的微量代谢产物进行分析确证,探索LC-MS在代谢转化研究中的应用。方法:利用柱后补偿技术,采用正离子检测对大鼠肝微粒体中(+),(-)-黄皮酰胺及其代谢产物进行HPLC-ESI-MS分析,根据MS的碎片信息检测主要的代谢产物,特别是对未分离得......


摘 要:目的:建立黄皮酰胺及其代谢产物的HPLC-ESI-MS在线检测分析方法,并对未分离得到的微量代谢产物进行分析确证,探索LC-MS在代谢转化研究中的应用。方法:利用柱后补偿技术,采用正离子检测对大鼠肝微粒体中(+),(-)-黄皮酰胺及其代谢产物进行HPLC-ESI-MS分析,根据MS的碎片信息检测主要的代谢产物,特别是对未分离得到的代谢产物的结构碎片进行分析,确定其结构。

结果:除检测出主要已知代谢产物外,尚检测出一新的代谢产物,通过质谱碎片分析推断其结构为3-去氢黄皮酰胺,进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。

结论:LC-MS用于代谢转化的研究,方便快速,为该技术在代谢转化中的应用提供了一种参考.

关键词:(+),(-)-黄皮酰胺 肝微粒体 体外代谢 高效液相色谱-质谱 电喷雾

LC-MS Analysis of (+) and (-)-Clausenamide
and Their Metabolites in Rat Liver Microsomes

Yao Qingqiang Wang Yan Wang Muzou
Institute of materia medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050
Yang Shumin
China Doping Control Center,Beijing 100029

AbstractObjectivesThe HPLC-ESI-MS on line analytical method was developed for the determination of the minute metabolites of (+) and (-)-clausenamide after incubation with rat liver microsomes.Methods:The HPLC-MS analysis of (+) and (-)-clausenamide and their metabolites was used with post-column modification and positive polarity.The structures of the metabolites were analyzed by their MS data. Results:Besides the main known metabolites,an unknown metabolite,3-dehydroclausenamide was determined. Conclusion:The metabolic pathway of clausenamide was complemented by this research and the LC-MS method is a very useful method in the research of drug metabolism.
Key words(+) and (-)-clausenamide,liver microsome,metabolism in vitro,high performance liquid chromatography-mass spectrometry,electrospray ionization

  黄皮酰胺是芸香科黄皮属植物黄皮Clausena lansium(Lour.)Skeels叶水浸膏中分离得到的有效成分[1],经不对称合成和拆分得到左旋和右旋黄皮酰胺[2],其中左旋体有较好的促智作用,右旋体作用不明显且有较强的毒性[3,4],其化学结构见图1。


图1 (-)和(+)-黄皮酰胺的结构

  我们曾报道了左旋及右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化[5,6],分离纯化了6个代谢产物,通过1H-NMR,FAB-MS,EI-MS鉴定其结构分别为:6-羟基-(CM1),5-羟基-(CM2),4-羟基-(CM3),4,6-二羟基-(CM4),4-苯环邻位-羟基-(CM5),4,7-苯环间位-二羟基-(CM6)黄皮酰胺。为进一步寻找未分离得到的代谢产物,并拟探索液相色谱-质谱联用技术在代谢转化研究中的应用,本文对黄皮酰胺及其代谢产物进行了HPLC-ESI-MS在线分析,分别检测出了肝微粒体温孵体系中的(-),(+)-黄皮酰胺及其主要已知的代谢产物,并根据结构碎片信息,推断出一个未报道的代谢产物,其结构为3-去氢黄皮酰胺(3-dehydroclausenamide,CM7),进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。

1 材料与仪器

  (+),(-)-黄皮酰胺由本所合成室提供,其结构经光谱鉴定。
NADP(氧化型辅酶Ⅱ);NADH(还原型辅酶Ⅰ)(进口分装)购自北京百泰生化试剂公司,G-6-P(6-磷酸葡萄糖),G-6-P dehydrogenase(G-6-P DH,G-6-P脱氢酶)为Sigma公司产品,苯巴比妥钠(PB,药用,进口分装),乙腈为色谱纯,其他化学品均为市售分析纯,水为蒸馏水经Milli Q Labo纯水器处理。
(250±10) g雄性纯种Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物中心提供。
惠普公司HP1090高效液相色谱仪,1994A化学工作站,HP5987A电喷雾接口,HP5989B质谱仪。

2 实验方法

2.1 动物的诱导与肝微粒体的制备 Wistar种大鼠,ip PB生理盐水溶液60 mg.kg-1,每天1次,连续3 d。按文献报道的2次离心法制备肝微粒体[7],用Lowry法测定蛋白含量[8]
2.2 温孵体系的组成及样品的制备 微粒体蛋白2.0 mg.mL-1;G-6-P 10 mmol.L-1;NADP1 mmol.L-1;NADH 0.5 mmol.L-1;G-6-P DH 1 IU.mL-1;MgCl2 4.0 mmol.L-1;黄皮酰胺1.5 mg.mL-1。按以上组成分别对(-),(+)-黄皮酰胺温孵1.5 h。
取1 mL温孵产物用乙酸乙酯1 mL×3提取,合并有机层,无水Na
2SO4干燥,减压蒸干,残留物溶于甲醇1 mL中,取5 μL进行分析。
2.3 液相色谱-质谱操作条件 色谱柱:Zorbax C18,5 μm,2.1 mm×150 mm;流动相:MeCN-H2O(95∶5);流速:0.3 mL.min-1,柱后补偿:1%冰乙酸,流速:1 mL.min-1;喷雾器压力:552 kPa;电喷雾接口干燥气(N2)流速:10 L.min-1,温度:350 ℃;碰撞诱导解离(Collision-induced-dissociation,CID)电压;150 V;极性(即检出模式):正离子;四极杆温度:150 ℃;电离电压:10 000 V;采集步长:0.10。

3 结果

3.1 右旋黄皮酰胺温孵体系中代谢产物的LC-ESI-MS分析 图2是右旋黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图,tR=9.804 min的峰为母体药,其质谱图及解析见图3。另外,尚检测出CM1(tR=9.140 min),CM3(tR=8.902 min),CM5(tR=7.889 min),其质谱图及解析见图4,5,6。图7是tR=10.403 min峰的质谱图,m/z 296为M++1峰,经分析,m/z 224,172,163,118,102为M++1峰相关的碎片。该代谢物分子量比母体药小2个质量单位,为脱氢的结果;根据代谢的一般规律,黄皮酰胺分子中3-位,7-位羟基可以产生脱氢反应。7-位脱氢产物为黄皮酰胺酮,经与标准品对照,与tR=10.403 min的峰保留时间不同。故推断该代谢产物结构为3-去氢黄皮酰胺。MS碎片裂解规律(见图7的解析)支持以上结构推断。3-去氢黄皮酰胺产生的过程见图8。


图2 肝微粒体温孵体系中(+)-黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图

图3 肝微粒体温孵体系中(+)-黄皮酰胺的MS图谱
解析:298(M
++H),171(M+-PhCH2OH-H2O),163(298-Ph.CHOH-CO),130(163-.CH3-H2O),102(298-Ph.CHOH-HCONHCH3-CH2O)

图4 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM1的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),279(296-OH),190(314-Ph CHOH-OH),163(190-CO+H),130(314-PhCHOH-Ph),120(314-PhCHOH-CH2OH-2CO),118(314-O=C=NCH3-Ph-CO-H2O),102(130-CO)

图5 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM3的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),224(296-2CO-OH+H),190(314-Ph CHOH-OH),
172(190-H
2O),130(314-Ph CHOH-Ph),118(190-CO-CHO-CH3),102(130-CO)

图6 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM5的MS图谱
解析:314(M
++H),295(M+-H2O),272(314-CO-CH3+H),163(314-Ph CHOH-CO-OH+H),
120(163-CH
3-CO),102(314-Ph CHOH-O=C=NCH3-CH2O-H2O)

图7 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中3-去氢黄皮酰胺的MS图谱
解析:296(M
++H),224(296-2CO-OH+H),172(296-Ph CHOH-OH),163(296-O=C=
NCH
3-Ph+H),118(296-Ph CHOH-2CO-CH3),102(296-Ph CHOH-HCONHCH3-CO)

图8 3-去氢黄皮酰胺产生的过程

3.2 左旋黄皮酰胺温孵体系中代谢产物的LC-ESI-MS分析 图9是左旋黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图。tR=9.747 min的峰为母体药,其质谱图及解析见图10。检测出的代谢产物为CM1(tR=9.369 min),CM2(tR=9.186 min),CM3(tR=8.906 min),CM5(tR=7.832),3-去氢黄皮酰胺(tR=10.431 min),其质谱图及解析分别见图11,12,13,14,15。

图9 肝微粒体温孵体系中(-)-黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图

图10 肝微粒体温孵体系中(-)-黄皮酰胺的MS图谱
解析:298(M
++H),171(M+-PhCH2OH-H2O),163(298-Ph CHOH-CO),102(298-Ph CHOH-HCONHCH3-CH2O)

图11 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM1的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),171(314-Ph CHOH-2H2O),120(314-Ph CHOH-2CO-CH2OH),102(314-Ph CHOH-Ph-CO)

图12 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM2的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),247(278-CH2OH),123(314-Ph CHOH-O=C=NCH3-CO+H),105(123-H2O)

图13 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM3的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),258(314-2CO),190(314-Ph CHOH-OH),149(314-Ph CHOH-CONHCH3),120(149-CHO)

图14 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM5的MS图谱
解析:314(M
++H),295(M+-H2O),229(314-O=C=NCH3-CO),130(314-Ph CHOH-HCONHCH3-H2O),120(314-Ph CHOH-HCONHCH3-CO),118(229-HOPh-H2O)

图15 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中3-去氢黄皮酰胺的MS图谱
解析:296(M
++H),118(296-Ph CHOH-2CO-CH3),102(296-Ph CHOH-HCONHCH3-CO)

4 讨论

  通过大鼠肝微粒体温孵法曾分离得到6个黄皮酰胺的代谢产物,并通过1H-NMR,MS分析确定了它们的结构,从而确定了黄皮酰胺的主要代谢途径[5,6]。但研究中发现,代谢体系中仍有一些微量代谢产物,由于量小分析制备较为困难。故进一步对代谢后的黄皮酰胺直接进行在线分析测试,从获得的质谱碎片提供的信息,得到一个新的代谢产物结构,即3-去氢黄皮酰胺,从而进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。
黄皮酰胺的代谢转化途径推断见图16。


图16 黄皮酰胺的代谢途径

  黄皮酰胺及其代谢产物结构中含有多个羟基,极性较大,不易气化,而衍生化由于羟基太多较为困难,不易采用GC-MS研究。而HPLC-MS联用技术勿需衍生化,且由于采用软电离技术能得到代谢物的分子离子峰,通过外加诱导碰撞解离(CID)电压使之产生一定的碎片提供结构信息,本文报道的代谢产物3-去氢黄皮酰胺就是根据分子离子峰及所产生的结构碎片而推断得到的。
由于所采用的流动相中不含酸或碱性成分,本研究采用柱后补偿技术,以1%冰醋酸采用正离子检测获得了较好的灵敏度。■

作者单位:姚庆强(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)
王琰(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)
杨树民(中国兴奋剂检测中心,北京 100029)
王慕邹(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)

参考文献

[1]杨明河,曹延怀,李伟勋等.黄皮叶中黄皮酰胺的分离和结构测定.药学学报,1987,22:33
[2]饶尔昌,程家宠,杨光中等.黄皮酰胺的合成.药学学报,1994,29:502
[3]张均田,蒋学英.黄皮酰胺促智作用机制的研究.中国医学科学院、中国协和医科大学年会论文集.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1994.356
[4]段文贞,张均田.(-),(+)-黄皮酰胺对鼠脑内NMDA受体的影响.药学学报,1997,32:259
[5]姚庆强,王慕邹.左旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化研究.药学学报,1998,33:296
[6]姚庆强,王慕邹.右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化研究.药学学报,1999,34:303
[7]Gibson GG,Skett P.Introduction to Drug Metabolism.London:Chapman and Hall,1986.240
[8]Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with Folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265

收稿日期:1998-11-10

 

摘 要:目的:建立黄皮酰胺及其代谢产物的HPLC-ESI-MS在线检测分析方法,并对未分离得到的微量代谢产物进行分析确证,探索LC-MS在代谢转化研究中的应用。方法:利用柱后补偿技术,采用正离子检测对大鼠肝微粒体中(+),(-)-黄皮酰胺及其代谢产物进行HPLC-ESI-MS分析,根据MS的碎片信息检测主要的代谢产物,特别是对未分离得到的代谢产物的结构碎片进行分析,确定其结构。

结果:除检测出主要已知代谢产物外,尚检测出一新的代谢产物,通过质谱碎片分析推断其结构为3-去氢黄皮酰胺,进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。

结论:LC-MS用于代谢转化的研究,方便快速,为该技术在代谢转化中的应用提供了一种参考.

关键词:(+),(-)-黄皮酰胺 肝微粒体 体外代谢 高效液相色谱-质谱 电喷雾

LC-MS Analysis of (+) and (-)-Clausenamide
and Their Metabolites in Rat Liver Microsomes

Yao Qingqiang Wang Yan Wang Muzou
Institute of materia medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050
Yang Shumin
China Doping Control Center,Beijing 100029

AbstractObjectivesThe HPLC-ESI-MS on line analytical method was developed for the determination of the minute metabolites of (+) and (-)-clausenamide after incubation with rat liver microsomes.Methods:The HPLC-MS analysis of (+) and (-)-clausenamide and their metabolites was used with post-column modification and positive polarity.The structures of the metabolites were analyzed by their MS data. Results:Besides the main known metabolites,an unknown metabolite,3-dehydroclausenamide was determined. Conclusion:The metabolic pathway of clausenamide was complemented by this research and the LC-MS method is a very useful method in the research of drug metabolism.
Key words(+) and (-)-clausenamide,liver microsome,metabolism in vitro,high performance liquid chromatography-mass spectrometry,electrospray ionization

  黄皮酰胺是芸香科黄皮属植物黄皮Clausena lansium(Lour.)Skeels叶水浸膏中分离得到的有效成分[1],经不对称合成和拆分得到左旋和右旋黄皮酰胺[2],其中左旋体有较好的促智作用,右旋体作用不明显且有较强的毒性[3,4],其化学结构见图1。


图1 (-)和(+)-黄皮酰胺的结构

  我们曾报道了左旋及右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化[5,6],分离纯化了6个代谢产物,通过1H-NMR,FAB-MS,EI-MS鉴定其结构分别为:6-羟基-(CM1),5-羟基-(CM2),4-羟基-(CM3),4,6-二羟基-(CM4),4-苯环邻位-羟基-(CM5),4,7-苯环间位-二羟基-(CM6)黄皮酰胺。为进一步寻找未分离得到的代谢产物,并拟探索液相色谱-质谱联用技术在代谢转化研究中的应用,本文对黄皮酰胺及其代谢产物进行了HPLC-ESI-MS在线分析,分别检测出了肝微粒体温孵体系中的(-),(+)-黄皮酰胺及其主要已知的代谢产物,并根据结构碎片信息,推断出一个未报道的代谢产物,其结构为3-去氢黄皮酰胺(3-dehydroclausenamide,CM7),进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。

1 材料与仪器

  (+),(-)-黄皮酰胺由本所合成室提供,其结构经光谱鉴定。
NADP(氧化型辅酶Ⅱ);NADH(还原型辅酶Ⅰ)(进口分装)购自北京百泰生化试剂公司,G-6-P(6-磷酸葡萄糖),G-6-P dehydrogenase(G-6-P DH,G-6-P脱氢酶)为Sigma公司产品,苯巴比妥钠(PB,药用,进口分装),乙腈为色谱纯,其他化学品均为市售分析纯,水为蒸馏水经Milli Q Labo纯水器处理。
(250±10) g雄性纯种Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物中心提供。
惠普公司HP1090高效液相色谱仪,1994A化学工作站,HP5987A电喷雾接口,HP5989B质谱仪。

2 实验方法

2.1 动物的诱导与肝微粒体的制备 Wistar种大鼠,ip PB生理盐水溶液60 mg.kg-1,每天1次,连续3 d。按文献报道的2次离心法制备肝微粒体[7],用Lowry法测定蛋白含量[8]
2.2 温孵体系的组成及样品的制备 微粒体蛋白2.0 mg.mL-1;G-6-P 10 mmol.L-1;NADP1 mmol.L-1;NADH 0.5 mmol.L-1;G-6-P DH 1 IU.mL-1;MgCl2 4.0 mmol.L-1;黄皮酰胺1.5 mg.mL-1。按以上组成分别对(-),(+)-黄皮酰胺温孵1.5 h。
取1 mL温孵产物用乙酸乙酯1 mL×3提取,合并有机层,无水Na
2SO4干燥,减压蒸干,残留物溶于甲醇1 mL中,取5 μL进行分析。
2.3 液相色谱-质谱操作条件 色谱柱:Zorbax C18,5 μm,2.1 mm×150 mm;流动相:MeCN-H2O(95∶5);流速:0.3 mL.min-1,柱后补偿:1%冰乙酸,流速:1 mL.min-1;喷雾器压力:552 kPa;电喷雾接口干燥气(N2)流速:10 L.min-1,温度:350 ℃;碰撞诱导解离(Collision-induced-dissociation,CID)电压;150 V;极性(即检出模式):正离子;四极杆温度:150 ℃;电离电压:10 000 V;采集步长:0.10。

3 结果

3.1 右旋黄皮酰胺温孵体系中代谢产物的LC-ESI-MS分析 图2是右旋黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图,tR=9.804 min的峰为母体药,其质谱图及解析见图3。另外,尚检测出CM1(tR=9.140 min),CM3(tR=8.902 min),CM5(tR=7.889 min),其质谱图及解析见图4,5,6。图7是tR=10.403 min峰的质谱图,m/z 296为M++1峰,经分析,m/z 224,172,163,118,102为M++1峰相关的碎片。该代谢物分子量比母体药小2个质量单位,为脱氢的结果;根据代谢的一般规律,黄皮酰胺分子中3-位,7-位羟基可以产生脱氢反应。7-位脱氢产物为黄皮酰胺酮,经与标准品对照,与tR=10.403 min的峰保留时间不同。故推断该代谢产物结构为3-去氢黄皮酰胺。MS碎片裂解规律(见图7的解析)支持以上结构推断。3-去氢黄皮酰胺产生的过程见图8。


图2 肝微粒体温孵体系中(+)-黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图

图3 肝微粒体温孵体系中(+)-黄皮酰胺的MS图谱
解析:298(M
++H),171(M+-PhCH2OH-H2O),163(298-Ph.CHOH-CO),130(163-.CH3-H2O),102(298-Ph.CHOH-HCONHCH3-CH2O)

图4 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM1的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),279(296-OH),190(314-Ph CHOH-OH),163(190-CO+H),130(314-PhCHOH-Ph),120(314-PhCHOH-CH2OH-2CO),118(314-O=C=NCH3-Ph-CO-H2O),102(130-CO)

图5 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM3的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),224(296-2CO-OH+H),190(314-Ph CHOH-OH),
172(190-H
2O),130(314-Ph CHOH-Ph),118(190-CO-CHO-CH3),102(130-CO)

图6 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM5的MS图谱
解析:314(M
++H),295(M+-H2O),272(314-CO-CH3+H),163(314-Ph CHOH-CO-OH+H),
120(163-CH
3-CO),102(314-Ph CHOH-O=C=NCH3-CH2O-H2O)

图7 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中3-去氢黄皮酰胺的MS图谱
解析:296(M
++H),224(296-2CO-OH+H),172(296-Ph CHOH-OH),163(296-O=C=
NCH
3-Ph+H),118(296-Ph CHOH-2CO-CH3),102(296-Ph CHOH-HCONHCH3-CO)

图8 3-去氢黄皮酰胺产生的过程

3.2 左旋黄皮酰胺温孵体系中代谢产物的LC-ESI-MS分析 图9是左旋黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图。tR=9.747 min的峰为母体药,其质谱图及解析见图10。检测出的代谢产物为CM1(tR=9.369 min),CM2(tR=9.186 min),CM3(tR=8.906 min),CM5(tR=7.832),3-去氢黄皮酰胺(tR=10.431 min),其质谱图及解析分别见图11,12,13,14,15。

图9 肝微粒体温孵体系中(-)-黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图

图10 肝微粒体温孵体系中(-)-黄皮酰胺的MS图谱
解析:298(M
++H),171(M+-PhCH2OH-H2O),163(298-Ph CHOH-CO),102(298-Ph CHOH-HCONHCH3-CH2O)

图11 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM1的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),171(314-Ph CHOH-2H2O),120(314-Ph CHOH-2CO-CH2OH),102(314-Ph CHOH-Ph-CO)

图12 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM2的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),247(278-CH2OH),123(314-Ph CHOH-O=C=NCH3-CO+H),105(123-H2O)

图13 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM3的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),258(314-2CO),190(314-Ph CHOH-OH),149(314-Ph CHOH-CONHCH3),120(149-CHO)

图14 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM5的MS图谱
解析:314(M
++H),295(M+-H2O),229(314-O=C=NCH3-CO),130(314-Ph CHOH-HCONHCH3-H2O),120(314-Ph CHOH-HCONHCH3-CO),118(229-HOPh-H2O)

图15 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中3-去氢黄皮酰胺的MS图谱
解析:296(M
++H),118(296-Ph CHOH-2CO-CH3),102(296-Ph CHOH-HCONHCH3-CO)

4 讨论

  通过大鼠肝微粒体温孵法曾分离得到6个黄皮酰胺的代谢产物,并通过1H-NMR,MS分析确定了它们的结构,从而确定了黄皮酰胺的主要代谢途径[5,6]。但研究中发现,代谢体系中仍有一些微量代谢产物,由于量小分析制备较为困难。故进一步对代谢后的黄皮酰胺直接进行在线分析测试,从获得的质谱碎片提供的信息,得到一个新的代谢产物结构,即3-去氢黄皮酰胺,从而进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。
黄皮酰胺的代谢转化途径推断见图16。


图16 黄皮酰胺的代谢途径

  黄皮酰胺及其代谢产物结构中含有多个羟基,极性较大,不易气化,而衍生化由于羟基太多较为困难,不易采用GC-MS研究。而HPLC-MS联用技术勿需衍生化,且由于采用软电离技术能得到代谢物的分子离子峰,通过外加诱导碰撞解离(CID)电压使之产生一定的碎片提供结构信息,本文报道的代谢产物3-去氢黄皮酰胺就是根据分子离子峰及所产生的结构碎片而推断得到的。
由于所采用的流动相中不含酸或碱性成分,本研究采用柱后补偿技术,以1%冰醋酸采用正离子检测获得了较好的灵敏度。■

作者单位:姚庆强(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)
王琰(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)
杨树民(中国兴奋剂检测中心,北京 100029)
王慕邹(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)

参考文献

[1]杨明河,曹延怀,李伟勋等.黄皮叶中黄皮酰胺的分离和结构测定.药学学报,1987,22:33
[2]饶尔昌,程家宠,杨光中等.黄皮酰胺的合成.药学学报,1994,29:502
[3]张均田,蒋学英.黄皮酰胺促智作用机制的研究.中国医学科学院、中国协和医科大学年会论文集.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1994.356
[4]段文贞,张均田.(-),(+)-黄皮酰胺对鼠脑内NMDA受体的影响.药学学报,1997,32:259
[5]姚庆强,王慕邹.左旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化研究.药学学报,1998,33:296
[6]姚庆强,王慕邹.右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化研究.药学学报,1999,34:303
[7]Gibson GG,Skett P.Introduction to Drug Metabolism.London:Chapman and Hall,1986.240
[8]Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with Folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265

收稿日期:1998-11-10

 

摘 要:目的:建立黄皮酰胺及其代谢产物的HPLC-ESI-MS在线检测分析方法,并对未分离得到的微量代谢产物进行分析确证,探索LC-MS在代谢转化研究中的应用。方法:利用柱后补偿技术,采用正离子检测对大鼠肝微粒体中(+),(-)-黄皮酰胺及其代谢产物进行HPLC-ESI-MS分析,根据MS的碎片信息检测主要的代谢产物,特别是对未分离得到的代谢产物的结构碎片进行分析,确定其结构。

结果:除检测出主要已知代谢产物外,尚检测出一新的代谢产物,通过质谱碎片分析推断其结构为3-去氢黄皮酰胺,进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。

结论:LC-MS用于代谢转化的研究,方便快速,为该技术在代谢转化中的应用提供了一种参考.

关键词:(+),(-)-黄皮酰胺 肝微粒体 体外代谢 高效液相色谱-质谱 电喷雾

LC-MS Analysis of (+) and (-)-Clausenamide
and Their Metabolites in Rat Liver Microsomes

Yao Qingqiang Wang Yan Wang Muzou
Institute of materia medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050
Yang Shumin
China Doping Control Center,Beijing 100029

AbstractObjectivesThe HPLC-ESI-MS on line analytical method was developed for the determination of the minute metabolites of (+) and (-)-clausenamide after incubation with rat liver microsomes.Methods:The HPLC-MS analysis of (+) and (-)-clausenamide and their metabolites was used with post-column modification and positive polarity.The structures of the metabolites were analyzed by their MS data. Results:Besides the main known metabolites,an unknown metabolite,3-dehydroclausenamide was determined. Conclusion:The metabolic pathway of clausenamide was complemented by this research and the LC-MS method is a very useful method in the research of drug metabolism.
Key words(+) and (-)-clausenamide,liver microsome,metabolism in vitro,high performance liquid chromatography-mass spectrometry,electrospray ionization

  黄皮酰胺是芸香科黄皮属植物黄皮Clausena lansium(Lour.)Skeels叶水浸膏中分离得到的有效成分[1],经不对称合成和拆分得到左旋和右旋黄皮酰胺[2],其中左旋体有较好的促智作用,右旋体作用不明显且有较强的毒性[3,4],其化学结构见图1。


图1 (-)和(+)-黄皮酰胺的结构

  我们曾报道了左旋及右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化[5,6],分离纯化了6个代谢产物,通过1H-NMR,FAB-MS,EI-MS鉴定其结构分别为:6-羟基-(CM1),5-羟基-(CM2),4-羟基-(CM3),4,6-二羟基-(CM4),4-苯环邻位-羟基-(CM5),4,7-苯环间位-二羟基-(CM6)黄皮酰胺。为进一步寻找未分离得到的代谢产物,并拟探索液相色谱-质谱联用技术在代谢转化研究中的应用,本文对黄皮酰胺及其代谢产物进行了HPLC-ESI-MS在线分析,分别检测出了肝微粒体温孵体系中的(-),(+)-黄皮酰胺及其主要已知的代谢产物,并根据结构碎片信息,推断出一个未报道的代谢产物,其结构为3-去氢黄皮酰胺(3-dehydroclausenamide,CM7),进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。

1 材料与仪器

  (+),(-)-黄皮酰胺由本所合成室提供,其结构经光谱鉴定。
NADP(氧化型辅酶Ⅱ);NADH(还原型辅酶Ⅰ)(进口分装)购自北京百泰生化试剂公司,G-6-P(6-磷酸葡萄糖),G-6-P dehydrogenase(G-6-P DH,G-6-P脱氢酶)为Sigma公司产品,苯巴比妥钠(PB,药用,进口分装),乙腈为色谱纯,其他化学品均为市售分析纯,水为蒸馏水经Milli Q Labo纯水器处理。
(250±10) g雄性纯种Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物中心提供。
惠普公司HP1090高效液相色谱仪,1994A化学工作站,HP5987A电喷雾接口,HP5989B质谱仪。

2 实验方法

2.1 动物的诱导与肝微粒体的制备 Wistar种大鼠,ip PB生理盐水溶液60 mg.kg-1,每天1次,连续3 d。按文献报道的2次离心法制备肝微粒体[7],用Lowry法测定蛋白含量[8]
2.2 温孵体系的组成及样品的制备 微粒体蛋白2.0 mg.mL-1;G-6-P 10 mmol.L-1;NADP1 mmol.L-1;NADH 0.5 mmol.L-1;G-6-P DH 1 IU.mL-1;MgCl2 4.0 mmol.L-1;黄皮酰胺1.5 mg.mL-1。按以上组成分别对(-),(+)-黄皮酰胺温孵1.5 h。
取1 mL温孵产物用乙酸乙酯1 mL×3提取,合并有机层,无水Na
2SO4干燥,减压蒸干,残留物溶于甲醇1 mL中,取5 μL进行分析。
2.3 液相色谱-质谱操作条件 色谱柱:Zorbax C18,5 μm,2.1 mm×150 mm;流动相:MeCN-H2O(95∶5);流速:0.3 mL.min-1,柱后补偿:1%冰乙酸,流速:1 mL.min-1;喷雾器压力:552 kPa;电喷雾接口干燥气(N2)流速:10 L.min-1,温度:350 ℃;碰撞诱导解离(Collision-induced-dissociation,CID)电压;150 V;极性(即检出模式):正离子;四极杆温度:150 ℃;电离电压:10 000 V;采集步长:0.10。

3 结果

3.1 右旋黄皮酰胺温孵体系中代谢产物的LC-ESI-MS分析 图2是右旋黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图,tR=9.804 min的峰为母体药,其质谱图及解析见图3。另外,尚检测出CM1(tR=9.140 min),CM3(tR=8.902 min),CM5(tR=7.889 min),其质谱图及解析见图4,5,6。图7是tR=10.403 min峰的质谱图,m/z 296为M++1峰,经分析,m/z 224,172,163,118,102为M++1峰相关的碎片。该代谢物分子量比母体药小2个质量单位,为脱氢的结果;根据代谢的一般规律,黄皮酰胺分子中3-位,7-位羟基可以产生脱氢反应。7-位脱氢产物为黄皮酰胺酮,经与标准品对照,与tR=10.403 min的峰保留时间不同。故推断该代谢产物结构为3-去氢黄皮酰胺。MS碎片裂解规律(见图7的解析)支持以上结构推断。3-去氢黄皮酰胺产生的过程见图8。


图2 肝微粒体温孵体系中(+)-黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图

图3 肝微粒体温孵体系中(+)-黄皮酰胺的MS图谱
解析:298(M
++H),171(M+-PhCH2OH-H2O),163(298-Ph.CHOH-CO),130(163-.CH3-H2O),102(298-Ph.CHOH-HCONHCH3-CH2O)

图4 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM1的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),279(296-OH),190(314-Ph CHOH-OH),163(190-CO+H),130(314-PhCHOH-Ph),120(314-PhCHOH-CH2OH-2CO),118(314-O=C=NCH3-Ph-CO-H2O),102(130-CO)

图5 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM3的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),224(296-2CO-OH+H),190(314-Ph CHOH-OH),
172(190-H
2O),130(314-Ph CHOH-Ph),118(190-CO-CHO-CH3),102(130-CO)

图6 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM5的MS图谱
解析:314(M
++H),295(M+-H2O),272(314-CO-CH3+H),163(314-Ph CHOH-CO-OH+H),
120(163-CH
3-CO),102(314-Ph CHOH-O=C=NCH3-CH2O-H2O)

图7 (+)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中3-去氢黄皮酰胺的MS图谱
解析:296(M
++H),224(296-2CO-OH+H),172(296-Ph CHOH-OH),163(296-O=C=
NCH
3-Ph+H),118(296-Ph CHOH-2CO-CH3),102(296-Ph CHOH-HCONHCH3-CO)

图8 3-去氢黄皮酰胺产生的过程

3.2 左旋黄皮酰胺温孵体系中代谢产物的LC-ESI-MS分析 图9是左旋黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图。tR=9.747 min的峰为母体药,其质谱图及解析见图10。检测出的代谢产物为CM1(tR=9.369 min),CM2(tR=9.186 min),CM3(tR=8.906 min),CM5(tR=7.832),3-去氢黄皮酰胺(tR=10.431 min),其质谱图及解析分别见图11,12,13,14,15。

图9 肝微粒体温孵体系中(-)-黄皮酰胺及其代谢产物的总离子流图

图10 肝微粒体温孵体系中(-)-黄皮酰胺的MS图谱
解析:298(M
++H),171(M+-PhCH2OH-H2O),163(298-Ph CHOH-CO),102(298-Ph CHOH-HCONHCH3-CH2O)

图11 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM1的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),171(314-Ph CHOH-2H2O),120(314-Ph CHOH-2CO-CH2OH),102(314-Ph CHOH-Ph-CO)

图12 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM2的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),247(278-CH2OH),123(314-Ph CHOH-O=C=NCH3-CO+H),105(123-H2O)

图13 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM3的MS图谱
解析:314(M
++H),296(314-H2O),278(296-H2O),258(314-2CO),190(314-Ph CHOH-OH),149(314-Ph CHOH-CONHCH3),120(149-CHO)

图14 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中CM5的MS图谱
解析:314(M
++H),295(M+-H2O),229(314-O=C=NCH3-CO),130(314-Ph CHOH-HCONHCH3-H2O),120(314-Ph CHOH-HCONHCH3-CO),118(229-HOPh-H2O)

图15 (-)-黄皮酰胺微粒体温孵体系中3-去氢黄皮酰胺的MS图谱
解析:296(M
++H),118(296-Ph CHOH-2CO-CH3),102(296-Ph CHOH-HCONHCH3-CO)

4 讨论

  通过大鼠肝微粒体温孵法曾分离得到6个黄皮酰胺的代谢产物,并通过1H-NMR,MS分析确定了它们的结构,从而确定了黄皮酰胺的主要代谢途径[5,6]。但研究中发现,代谢体系中仍有一些微量代谢产物,由于量小分析制备较为困难。故进一步对代谢后的黄皮酰胺直接进行在线分析测试,从获得的质谱碎片提供的信息,得到一个新的代谢产物结构,即3-去氢黄皮酰胺,从而进一步完善了黄皮酰胺的代谢途径。
黄皮酰胺的代谢转化途径推断见图16。


图16 黄皮酰胺的代谢途径

  黄皮酰胺及其代谢产物结构中含有多个羟基,极性较大,不易气化,而衍生化由于羟基太多较为困难,不易采用GC-MS研究。而HPLC-MS联用技术勿需衍生化,且由于采用软电离技术能得到代谢物的分子离子峰,通过外加诱导碰撞解离(CID)电压使之产生一定的碎片提供结构信息,本文报道的代谢产物3-去氢黄皮酰胺就是根据分子离子峰及所产生的结构碎片而推断得到的。
由于所采用的流动相中不含酸或碱性成分,本研究采用柱后补偿技术,以1%冰醋酸采用正离子检测获得了较好的灵敏度。■

作者单位:姚庆强(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)
王琰(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)
杨树民(中国兴奋剂检测中心,北京 100029)
王慕邹(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 北京 100050)

参考文献

[1]杨明河,曹延怀,李伟勋等.黄皮叶中黄皮酰胺的分离和结构测定.药学学报,1987,22:33
[2]饶尔昌,程家宠,杨光中等.黄皮酰胺的合成.药学学报,1994,29:502
[3]张均田,蒋学英.黄皮酰胺促智作用机制的研究.中国医学科学院、中国协和医科大学年会论文集.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1994.356
[4]段文贞,张均田.(-),(+)-黄皮酰胺对鼠脑内NMDA受体的影响.药学学报,1997,32:259
[5]姚庆强,王慕邹.左旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化研究.药学学报,1998,33:296
[6]姚庆强,王慕邹.右旋黄皮酰胺在大鼠肝微粒体中的代谢转化研究.药学学报,1999,34:303
[7]Gibson GG,Skett P.Introduction to Drug Metabolism.London:Chapman and Hall,1986.240
[8]Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with Folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265

收稿日期:1998-11-10

 


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