高效液相色谱－间接光度检测法同时测定血清和尿中5种氨基苷类抗生素

　　摘要　目的：建立一种直接分离测定体液中庆大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、西梭霉素和乙基西梭霉素等5种氨基苷类抗生素的高效液相色谱-间接光度检测(HPLC-IPD)法。
方法：在流动相中加入具有紫外检测响应的检测剂烟酰胺,用紫外检测器直接测定紫外吸收很差的上述5种药物。C₁₈固定相,流动相为含烟酰胺0.5　m mol^.L^-1、庚烷磺酸钠5 m mol^.L^-1和磷酸0.05 mol^.L^-1的甲醇－乙腈－水(27∶18∶55)混合溶液。
结果：血清和尿样平均回收率均大于96 %,日内和日间RSD均小于6%。并测定了肌注此类药物病人的血清和尿样品。
结论：该法适于体液中氨基苷类药物检测。

Determination of Aminoglycosides in Body Fluid by High　Performance Liquid Chromatographic－Indirect Photomation Determination Method

Yuan Cheng, Jia Nuan, Wang Jingxiang and Liu Shufen
(General Hospital of Jinan Milltary Command, Jinan　250031)

　　Abstract　Objective：High performance liquid chromatographic－indirect photomation determination(HPLC－IPD) method was adapted to directly determine the drugs without ultraviolet absorption through putting in nicotinamide, was builted for separating and determining gentamycin, amikacin, tobramycin, sisomicin and netilmicin in serum and urine.Methods:The experimental conditions in the method were using a C₁₈ column and a mixture of methyl alcohol-acetonitrile－water(27∶18∶55) contained nicotinamide 0.5 m mol^.L^-1, sodium 1-heptanesulfonate 5 m mol^.L^-1 and phosphoric acid 0.05 mol^.L^-1, as mobile phase, sensitivity of 0.05AUFS. The detectable wavelength was fixed at 268 nm.Results:The average recovery for above 5 drugs in serum and urine was over 96 % and RSD was not over 6 % for within－day and day－to－day tests respectively. The concentration of 5 drugs of 5 patients were determined.Conclusion:This HPLC－IPD method can be used to determine the aminoglycosides in body fluid.
　　Key words　gentamycin, amikacin, tobramycin, sisomicin, netilmicin, HPLC－IPD

　　氨基苷类抗生素是临床常用的一大类抗生素,此类药物无紫外吸收,体液中药物的高效液相测定法一般采用柱前衍生化荧光或紫外检测法^［1～3］等,操作较繁琐。而采用高效液相色谱-间接光度检测(HPLC－indirect photomation determination, HPLC－IPD)法,在流动相中加入具有紫外检测响应的检测剂烟酰胺,烟酰胺与庚烷磺酸钠形成的离子对及药物与庚烷磺酸钠形成的离子对竞争固定相有限结合容量,从而使检测剂的浓度随流动相的迁移不断发生改变,导致背景信号发生变化而产生色谱响应^［4,5］，实现用紫外检测器直接分离和测定临床应用最多、结构相似的5种氨基苷类抗生素的体液含量,为该类药物的临床监测提供简便方法。
1　试药与方法
1.1　仪器与试药　高效液相色谱系统：510泵,U6K进样器,490E检测器,Baseline 810色谱操作处理工作站(Waters公司);色谱柱(中科院大连化学物理所); AT－130色谱柱保温器(天津金洲科学仪器公司)。庆大霉素(Gentamycin)、丁胺卡那霉素(Amikacin)和妥布霉素(Tobramycin)对照品(供含量测定用,中国药品生物制品检定所);西梭霉素(Sisomicin)对照品(Sigma公司,色谱定量用);乙基西梭霉素(Netilmicin)对照品(青岛抗生素制药厂,含量大于99.8%)。庚烷磺酸钠(东京化成工业株式会社,AR);烟酰胺(上海试剂二厂,AR);乙腈和甲醇为色谱纯,其余试剂为GR和AR级。
1.2　样品处理方法　血清：精取血清样品0.5 mL,精密加入0.01 mol*L^-1的氢氧化钠溶液0.1 mL,振荡混匀,精取乙酸乙酯－氯仿(4∶1)混合液5 mL萃取,精密量取有机层4 mL,于50 ℃水浴中用氮气流吹干,精密量取流动相0.1 mL溶解后进样15 μL。尿液：精密量取尿样品5 mL,精密加入5 %的三氯乙酸溶液5 mL,混匀,离心,取上清液10 μL进样。
2　结果与讨论
2.1　色谱条件的选择
2.1.1　烟酰胺浓度　烟酰胺是流动相中不影响分离度的因素,因此单独选择。由于本法是采用加入在紫外区有响应的检测剂来作为背景信号,通过背景信号的变化来达到间接检测供试物的目的,因此流动相中加入检测剂烟酰胺的浓度直接影响药物的出峰与否和噪音的大小,浓度太大,药物峰无法出现,浓度太小背景吸收易受干扰,噪音增大,影响测定的准确性,见图1,可见0.5 m mol^.L^-1为最佳浓度。

2.1.2　流动相中其他组分　磷酸含量影响药物及烟酰胺与庚烷磺酸钠的结合,和离子型药物多少;庚烷磺酸钠的含量决定药物的结合程度而影响药物的保留时间和峰的正负。采用序贯单纯形法^［6］确定流动相各组分配比：目标函数为色谱图分离度,决策变量数n＝4,甲醇为变量1,乙腈为变量2,庚烷磺酸钠为变量3,磷酸为变量4,最后加水(因变量)至1 L,由5个点组成单纯形。经过32次压缩收缩找到最佳配比点：甲醇－乙腈－水(27∶18∶55),除烟酰胺外含庚烷磺酸钠5 m mol^.L^-1和磷酸0.05 mol^.L^-1,流速1 mL^.min^-1。
2.1.3　固定相为Spherisorb C₁₈,粒径10 μm,柱规格4.6 mm×250 mm;检测波长268 nm;检测灵敏度0.05AUFS,柱温为(40±1) ℃。有关色谱图见图2。
2.2　线性范围
分别精密称取庆大霉素、妥布霉素、西梭霉素和乙基西梭霉素对照品0.1 g,丁胺卡那霉素0.4 g，共置25 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度,为混合对照品贮备液;取健康人血清和对照品贮备液适量,配成含前4种药物0.5、1、2、4、6、10 mg^.L^-1和丁胺卡那霉素1、2、4、8、16、24 mg^.L^-1的系列血清溶液,按“2.3”项下处理进样。同法制备含庆大霉素10、20、30、40、50、60mg^.L^-1、妥布霉素、西梭霉素和乙基西梭霉素30、40、50、55、60、70 mg^.L^-1及丁胺卡那霉素100、150、200、250、300、400 mg^.L^-1的尿混合溶液,进样。经Baseline 810系统处理,以峰高H对浓度C进行线性回归,结果见表1。

2.3　回收率和精密度　精密取对照品贮备液适量,按标准曲线浓度范围以体液样品为溶剂配制含高、中、低浓度药物的溶液,分别进样测定5次,连续测定5d,减去相应的空白对照的样品浓度,计算平均加样回收率及日内、日间误差,并按信噪比≥2计算检测限,结果见表2。
2.4　样品测定　呼吸系统感染患者5例,分别单剂量肌肉注射5种抗生素后1、5和12 h分别取血清0.5 mL,并收集患者0～12 h的尿,按上述方法处理后测定,根据浓度下降趋势判断患者给药后血药浓度半衰期约为2 h,与文献［7］记载相近,可见该方法是可行的;该类药物主要以原形自肾脏排泄,12 h累积排出量已达给药量的42 %～83 %；结果见表3。表明该方法作为该类药物药物动力学研究及体液浓度监测是可行的。

表1　线性方程、线性范围及相关系数

表2　血清和尿样品平均加样回收率、精密度及最低检测限实验结果(n＝3)

表3　患者血清和尿样品测定结果(mg^.L^-1)

作者单位：袁　成　贾　暖　王景祥　刘树芬　济南军区总医院药理科　济南　250031
本文于1998年2月5日收到

参考文献
1　林炳承,邹雄,韩培祯.高效液相色谱在生命科学中的应用.济南:山东科学技术出版社,1996.385
2　Matzke GR,Millikin SP,Kovarik JM.Variability in pharmacokinetic values for gentamicin tobramycin and netimicin in patients with renal insufficiency.Clin Pharm,1989,8：800
3　安登魁.药物分析.济南:济南出版社,1994.1612
4　周 炜,刘文英,安登魁.高效液相色谱间接光度检测法及其应用.国外医学(药学分册),1991,18(5):269
5　邹汉法,张玉奎,卢佩章.离子对高效液相色谱法.郑州:河南科学技术出版社,1994.197
6　丁养军,尤进茂.序贯单纯形法确定高效液相色谱流动相各组分的最佳配比.色谱,1995,13(6):477
7　郭瑞臣,傅平.现代临床药理学.赤峰：内蒙古科学技术出版社,1995.122