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用LC/MS/MS和RP-HPLC法对泻心汤煎煮产生的沉淀物的研究

来源:中国色谱网 作者:薛 燕周同惠 王小民 2007-5-18
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摘要: 摘要目的:用LC/MS/MS和RP-HPLC法研究泻心汤煎煮产生的沉淀物 。 方法:利用LC-MS-MS法对泻心汤沉淀物进行了初步研究, 又利用RP-HPLC法,测定了泻心汤沉淀物中小檗碱在小鼠体内的吸收。 结果:发现其中含有小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱,但在给小鼠灌服泻心汤沉淀物后24 h内的几个时间段......


 

摘要目的:用LC/MS/MS和RP-HPLC法研究泻心汤煎煮产生的沉淀物 。
方法:利用LC-MS-MS法对泻心汤沉淀物进行了初步研究, 又利用RP-HPLC法,测定了泻心汤沉淀物中小檗碱在小鼠体内的吸收。
结果:发现其中含有小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱,但在给小鼠灌服泻心汤沉淀物后24 h内的几个时间段中,均未能从血浆中测到小檗碱。
结论:泻心汤沉淀物进入体内后小檗碱并未进入血液,推测如果泻心汤沉淀物具有活性,估计也只可能在胃肠道起作用。

Studies on the Precipitate Produced in Preparation of Complex
Prescription of Chinese Herbal Medicines Xiexin Decoction
by LC/MS/MS and RP-HPLC

Xue Yan and Zhou Tonghui
Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050
Wang Xiaomin
Perkin-Elmer Sciex Instruments,Concord,Ont, Canada L4K 4V8

AbstractObjectiveTo study the precipitate formed during decocting of the Chinese herbal complex prescription Xiexin decoction and the absorption of the precipitate in rats.
Method: LC/MS/MS and reversed phase HPLC were used to study the precipitate and the berberine absorption in rats respectively.
Result: Berberine , palmatine, coptisine and jatrorrhizine were found in the precipitate, but no berberine was found in rat plasma after administration of the precipitate to rats.
Conclusion: It can be concluded that the Coptis alkaloids were precipitated off the decoction and when the precipitate entered the body , berberine did not go into the blood. Thus, if the precipitate possessed any biological activity , it would mainly function in the gastrointestinal ducts.
Key words LC/MS/MS, RPHPLC, Xiexin decoction, precipitate,berberine

  人们已经注意到中药中很多药物之间,如甘草与芒硝、麻黄、黄芩、黄连之间[1],大黄与茵陈、双花之间,苦参与大黄、黄芩、栀子之间[2],以及一些常用方剂,如泻心汤、葛根黄芩黄连汤[3]、白头翁汤[4]在煎煮时都会出现浑浊,产生沉淀,且在服用汤剂时,患者喝进的汤药,实际大多是一些含有沉淀物的混悬液。那么,这些沉淀物中都含有什么成分,进入体内后,是否会被吸收进入血液而发挥药效作用呢?为此,我们选择了中药复方中的经典方“泻心汤(黄连、大黄、黄芩)”对其沉淀物进行了研究。

1 材料与仪器
PE-SCIEXAPI365型LC/MS/MS联用仪;Waters510型输液泵,岛津SPD-2A紫外检测器,岛津C-R3A积分仪;盐酸小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱:中国药品生物制品检定所;硫酸奎尼丁,BDH ,为本室何丽一教授赠;十二烷基硫酸钠(分析纯),北京东环联合化工厂;其它试剂均为分析纯。大黄(蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.),黄连(毛莨科植物黄连Coptis chinensis Franch),黄芩( 唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi)购于市药材公司,并经我所植物室陈毓亨教授鉴定。18~22g♂昆明种小鼠,中国医学科学院动物所饲养场。

2 沉淀物化学成分的定性实验
2.1 泻心汤沉淀物的制备 
按泻心汤中药材量的配比关系:大黄-黄连-黄芩(2∶1∶1),分别称取大黄、黄连、黄芩各一定量,先后加4倍及2倍的水,煎煮2次,煎煮时间第一次为40min,第二次为30min,第一次煎煮前先用水浸泡30min,4层纱布过滤,合并2次滤液,置冰箱中过夜,次日离心过滤,弃去上清液,加水反复洗沉淀至水无色,干燥后备用。
2.2 样品液的准备 
沉淀物先溶解在二甲基亚砜中,再用甲醇-水(1∶1)溶液稀释成10 μg
.mL-1
2.3 色谱条件 
色谱柱:YMC-C
18分析柱(2.0mm×50mm),流动相:(A)含有2 m mol.L-1醋酸铵及0.2%甲酸的水;(B)含有2 m mol.L-1醋酸铵及0.2%甲酸的甲醇,流速:200μL.min-1,梯度条件:开始25%B、75%A,30min后90%B、10%A,进样量:10μL。
2.4 质谱条件 
质谱仪校准方式:聚丙烯二醇溶液校准, 离子化方式:高流速的离子喷雾,加热电离温度:450℃,电离电压:5500V(正离子方式),喷雾压力:275kPa,辅助气体流速:6.0 L
.min-1,屏障气体(curtain gas flow)流速:2.0L.min-1
2.5 结果 
按照前文已报道的方法
[5],每种化合物(小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱)先用流动注射方式以MS及MS/MS进行试验,以确定其前体离子(precursor ion),并选择产生离子(product ion)以及仪器操作条件,以便随后用LC/MS/MS模式进行多重反应监控实验[multiple reaction monitoring(MRM)experiment ],将泻心汤沉淀物的结果与标准图谱比较,确定泻心汤沉淀物中含有小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱。见表1与图1~3(图中给出小檗碱、巴马丁碱的质谱图,黄连碱、药根碱图及标准品的离子流图从略)。

表1 沉淀物中检出的物质及其性质

名称

分子离子
(m/z)

碎片离子
(m/z)

保留时间/
min

极性

黄连碱

320

292,277,262

7.98

+

药根碱

338

322,294

9.09

+

小檗碱

336

320,292,278

9.89

+

巴马丁碱

352

336,308

10.20

+

3 沉淀物中小檗碱的体内吸收实验
3.1 标准溶液
 
精密称取盐酸小檗碱0.767mg,用无水乙醇配成6.76、15.34、23.01、30.68 μg
.mL-1的标准溶液。
3.2 内标溶液 
精密称取硫酸奎尼丁3.553
mg,用无水乙醇配成35.53ng.μL-1内标溶液。

图1 泻心汤沉淀物与标准品产生离子质谱图的比较
A、B.泻心汤沉淀物 C.小檗碱 D.巴马丁碱

图2 泻心汤沉淀物几种成分产生离子的质谱图
A.黄连碱 B.药根碱 C.小檗碱 D.巴马丁碱

图3 泻心汤沉淀物一些成分的MRM离子流图
A.黄连碱 B.药根碱 C.小檗碱 D.巴马丁碱

3.3 生物样品的制备 
小鼠断头取血,枸橼酸钠抗凝,离心取血浆。取0.2mL放入带塞的离心管中,加入18%十二烷基硫酸钠水溶液40μL, 内标溶液40μL, 氯仿2mL,振荡离心15min后,弃去上清液,取下层氯仿液1.8mL,氮气吹干,残渣加无水乙醇100μL溶解,取10μL进样。
3.4 液相色谱条件 
色谱柱: Kromasil-100C18(150mm×4.0mm)分析柱,YWG-C18(50mm×4.6 mm)保护柱,流动相:0.2mol.L-1酒石酸(内含0.5%十二烷基硫酸钠)-甲醇(5∶17),流速:1.0 mL.min-1,柱温:室温,检测波长:270nm,灵敏度:0.08AUFS。
3.5 结果
3.5.1 样品处理 
用枸橼酸钠抗凝采血后,离心分离出血浆,取不同浓度的盐酸小檗碱标准溶液各20μL,分别加入内标溶液40μL , 放入带塞的离心管中挥干,加血浆0.2mL,18%的十二烷基硫酸钠水溶液40μL ,氯仿2mL,振荡离心后,弃去上清液,取下层氯仿液1.8mL,氮气吹干,残渣加100μL无水乙醇溶解,待测。
3.5.2 血浆中小檗碱的标准曲线及回收率
精密吸取0.3835mg.mL-1小檗碱储备液适量,配成不同浓度的标准溶液,各取20μL ,按样品处理项下进行操作,取10μL进样,得色谱图,见图4。将所得结果以小檗碱的浓度为横坐标,小檗碱与内标的峰面积之比为纵坐标作图,得小檗碱在血浆中的标准曲线,并求出回归方程为:

Y=3.548X+0.818 r=0.9993

小檗碱在0~30.68ng的范围内与峰面积之比呈线性关系。

图4 小檗碱的高效液相色谱图
A.小檗碱、内标物 B.空白血浆
C.加血浆后的小檗碱、内标物
1.小檗碱 2.内标物

  将小檗碱用流动相逐步稀释进样,以血浆为背景空白,当S/N为2时,小檗碱的最低检测量为6ng。
用血浆配制每1mL含小檗碱6.76、15.34、23.01、30.68μg的样品,按标准曲线项下进行操作,取10μL进样,计算实测值占加入值的百分率即得回收率。结果见表2。
3.5.3 灌服泻心汤沉淀物后测定不同时间内血浆中小檗碱的浓度 
用1%CMC-Na水溶液将泻心汤沉淀物(经测定,每100mg沉淀物中含6.651mg盐酸小檗碱)配成25mg.mL-1的混悬液,将24只小鼠分成8组,以250mg.kg-1的量给小鼠口服灌胃泻心汤沉淀物的混悬液,于灌胃后的30 min及1、2、3、4、6、8、24h的8个时间段断头取血,枸橼酸钠抗凝,取血浆0.2mL依前法进行操作,测定不同时间时血浆中小檗碱的含量,同一血样测定3次。结果,在灌服泻心汤沉淀物后24h内的各个时间段,均未能从血浆中测出小檗碱。

表2 血浆中小檗碱的回收率测定结果(n=4)

加入量/μg.mL-1

回收率/%

SD

6.76

98.17

9.39

15.34

92.86

2.84

23.01

101.95

7.71

30.68

105.77

6.32

4 讨论
在对泻心汤沉淀物的初步薄层色谱分离试验发现,沉淀物中含有许多成分,考虑到用LC/MS/MS仪对分析样品可以直接分离,不需要提纯,又能根据所得的质谱资料确定出结构等方面的优势,首次利用LC/MS/MS仪对泻心汤沉淀物进行了某些成分的结构鉴定,结果发现其中含有黄连中的4种生物碱:小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱。用这种仪器分析样品简便、快速,本实验也表明用它来研究成分复杂、提取分离工作量又大的中药来说,是一种更适合的分析手段。进一步将沉淀物给小鼠灌服,在其后的24h内的几个时间段中,均未能从血样中测到小檗碱。由此推测小檗碱以泻心汤沉淀物的形式可能无法进入血液中发挥作用。由于考虑到泻心汤在临床上的实际服用量,故在动物实验中未设其它剂量组。我们认为,泻心汤沉淀物中的小檗碱如果具有活性,应该也只能是在胃肠道起作用,因为胃液是酸性有利于小檗碱溶解,肠道是碱性使之不易吸收,小檗碱对肠道消炎作用可能是直接在肠道作用。再者,考虑到小檗碱在体内吸收较差,可以进一步选择泻心汤沉淀物中的其它成分来观察它们的体内吸收情况,并配合药理实验,以便最终确定沉淀物在泻心汤治疗全身性疾病时存在的必要性。

作者单位:薛燕 周同惠 中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所 北京100050
王小民 PE-SCIEX仪器公司 加拿大L4K 4V8

参考文献
1 富森 毅ら.甘草煎液中のグリチルリチン量におよぼす各种配合生药影响.生药药学志,1980,34(2):138
2 孙启明,李国庆.31种中草药注射液配伍的沉淀反应.药学通报,1981,16(4):40
3 野口 卫ら.黄连のアルカロイドと甘草および大黄の成分との汉方汤液中での沈殿反应について.汉方研究,1978,(4):122
4 丁林生,徐瑞华,吴振洁等.白头翁汤中小檗碱含量降低原因初探.中成药,1993, 5(1):18
5 Wang Xiaomin.Characterization of Traditional Chinese Medicine by Liquid Chromatography /Atmospheric Pressure Ionization Mass Spectrometry.J Food Drug Anal,1997,5(4) :337

收稿日期:1998-06-12

 


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