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知柏地黄丸质量标准研究

来源:(贵阳中医学院 作者: 2010-10-4
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摘要: 【摘要】 目的建立知柏地黄丸的质量标准。方法采用TLC法对知柏地黄丸中的山茱萸、牡丹皮、黄柏、知母进行定性鉴别。HPLC法测定知柏地黄丸中山茱萸中马钱苷的含量。结果薄层色谱鉴别专属性强。...


【摘要】 目的建立知柏地黄丸的质量标准。方法采用TLC法对知柏地黄丸中的山茱萸、牡丹皮、黄柏、知母进行定性鉴别;HPLC法测定知柏地黄丸中山茱萸中马钱苷的含量。结果薄层色谱鉴别专属性强。马钱苷线性关系良好,平均回收率符合规定。结论方法简便快速、结果准确,可有效控制知柏地黄丸的质量。

【关键词】  知柏地黄丸; 薄层色谱法 ; 高效液相色谱法; 质量标准

知柏地黄丸(浓缩丸)是由山茱萸、黄柏、知母、牡丹皮等8味中药组成的中药成方制剂,具有滋阴降火之功效,临床用于治疗阴虚火旺,潮热盗汗,口干咽痛,耳鸣遗精,小便短赤之症[1]。知柏地黄丸(浓缩丸)收载于卫生部药品标准,原标准项下除了收载的显微鉴别项和常规检查外,无其他检测项目[1]。方中山茱萸具有补益肝肾、涩精固脱等作用,其有效成分马钱苷测定的方法有高效液相色谱法[2~3],胶束电动毛细管色谱法[4]。为了进一步完善该品种质量标准,本实验建立了高效液相色谱法测定知柏地黄丸中(浓缩丸)的马钱苷的含量测定方法,取得了较为满意的结果。现报道如下。

  1  仪器与试药

  1.1  试剂与药材薄层色谱用硅胶G 、硅胶H、羧甲基纤维素钠(大连海洋化工厂);丹皮酚对照品(批号:0708-9704),熊果酸对照品(批号:110742-200516),盐酸小檗碱对照品(批号:0713-9906),菝契皂苷元对照品(批号:11074-200401),马钱苷对照品(批号:11640-200502)均由中国药品生物制品检定所提供,阴性样品由厂家提供。甲醇、乙腈(色谱纯);知柏地黄丸(河南宛西制药股份有限公司,批号050501,050502,050503);其它试剂均为AR级。

  1.2  仪器岛津LC-2010C高效液相色谱系统(日本岛津公司;包括:真空脱气机,四元梯度泵,自动进样器,DAD二极管阵列检测器),Solution色谱工作站(日本岛津公司);FA2104电子天平(上海精密仪器科学有限公司)。

  2  方法与结果

  2.1  薄层色谱鉴别

  2.1.1   牡丹皮取本品粉末15 g,加入乙醚20 ml,超声处理10 min,滤过,滤液挥干,残渣加丙酮2 ml使溶解,作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法[5]试验,吸取上述两种溶液10 μl,点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-甲苯-醋酸乙酯-盐酸(16∶8∶2∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。

  2.1.2  黄柏取本品粉末1 g,加入甲醇10 ml,超声处理15 min,滤过,滤液作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每毫升含0.5 mg的对照品溶液。照薄层色谱法[5]试验,吸取上述两种溶液1 μl,点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂,置氨蒸气预饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。

  2.1.3  山茱萸取本品粉末5 g,加入醋酸乙酯20 ml,超声处理15 min,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇2ml使溶解,作为供试品溶液。另取熊果酸对照品,加无水乙醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法[5]试验,吸取上述两种溶液5μl,点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)为展开剂,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。

  2.1.4  知母取本品粉末30 g,加入乙醚30 ml,超声处理10 min,滤过,弃去乙醚液,残渣挥尽乙醚后,加乙醇60 ml,加热回流1 h,滤过,滤液浓缩至20 ml,加盐酸2 ml,加热回流1 h后浓缩至约5 ml,加水10 ml,加石油醚(60~90℃)振摇提取2次,20 ml/次,合并石油醚液,用1%氢氧化钠溶液洗涤2次,20 ml/次,再用水洗涤2次,20 ml/次,分取石油醚液,蒸干,残渣加石油醚(60~90℃)1 ml使溶解,作为供试品溶液。另取菝契皂苷元对照品,加石油醚(60~90℃)制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法[5]试验,吸取上述两种溶液10 μl,点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-丙酮(9∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以8%香草醛无水乙醇溶液与硫酸溶液(7→10)的混合溶液(0.5:5),在100℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。

  2.2  含量测定

  2.2.1  对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品,加80%甲醇制成每毫升含马钱苷30 μg的溶液,即得。

  2.2.2  供试品溶液的制备取本品粉末约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇25 ml,称定重量,超声处理(功率 250 W,频率 40 kHz)20 min,放冷,再称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

  2.2.3  阴性对照溶液的制备 取缺山茱萸的阴性样品适量,按供试品溶液的制备方法制备,即得。

  2.2.4  色谱条件与系统适应性试验 色谱柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),ODS预柱;四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液(1∶6∶4∶89)为流动相;检测波长236 nm;流速1.0 ml/min;柱温40℃;理论塔板数按马钱苷峰计算不低于4 500。

  2.2.5  专属性试验照上述色谱条件,分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液20 μl,分别注入液相色谱仪。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照色谱在此保留时间无干扰,证明本法可行。结果见图1~3。

  2.2.6  标准曲线与线性范围精密称取常温减压干燥24 h的马钱苷对照品10.13 mg,置25 ml量瓶中,用80%甲醇溶解并稀释至刻度,即得含马钱苷0.405 2 mg/ml的马钱苷对照品母液,并稀释成不同浓度的马钱苷对照品子液。结果表明马钱苷在0.040 52~4.052μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,其回归方程为Y=2E+06x+5 664.1(r=1.000 0)。

  2.2.7   进样重复性分别精密吸取对照品溶液20 μl,连续进样6次,测得峰面积的RSD<1.5%。

  2.2.8  精密度实验
    
  中间精密度:分别取供试品溶液在0,1,2,4,6,10,12 h,分别进样20 μl,测得峰面积的RSD<1.5%,表明供试品溶液较稳定。
    
  重复性实验:取同一批供试样品,按样品测定项下方法,连续测定6次,测得含量结果的RSD<1.5%。表明样品重现性良好。

  2.2.9  加样回收率实验精密称取已知含量的样品约0.25 g,分别定量加入对照品,照供试品溶液制备方法和样品项下的方法测定。结果见表1。

  2.2.10  样品测定结果精密称取3批样品,制成供试品溶液,分别吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl,注入液相色谱仪,依法测定,计算马钱苷含量,结果分别为0.774 2,0.779 5,0.776 4 mg/g (n=3) 。

  表1  加样回收率实验结果(略)

  3  讨论
    
  有关山茱萸含量测定方法的研究颇多,主要是以熊果酸、齐墩果酸和马钱苷等为含量检测指标。山茱萸中熊果酸含量测定的文献报道虽比较多,但熊果酸存在于许多药材如山楂、马鞭草、车前草、紫珠、女贞子、怀牛膝等,非山茱萸的特有成分,并且熊果酸与齐墩果酸这两种成分在天然植物中又是共生共存的。熊果酸与齐墩果酸均属三萜酸,在化学结构上是差向异构体,两者极性几乎无差别。有实验表明,在薄层板上应用《中国药典》条件无法分离开,应用《中国药典》条件测得的熊果酸含量,实际为按熊果酸计算熊果酸与齐墩果酸含量的总和。马钱苷为山茱萸主要有效成分,测定其含量,可为山茱萸及其制剂提供质量控制的有效手段。
    
  实验过程中曾采用甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液等流动相系统。结果以四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液(1∶6∶4∶89)作为流动相能够将马钱苷峰与杂质峰较好的分离。
    
  在提取方法的选择上,以马钱苷含量作为考察指标,对提取溶剂进行考察:取样品1 g 3份,精密称定,分别精密加入甲醇,80%甲醇,50%甲醇25 ml,超声30 min。结果表明:用80%甲醇提取的含量较高,所以选用80%甲醇作为提取溶剂。对提取方式及时间进行考察:取样品1 g 6份,精密称定,精密加入80%甲醇25 ml,3份回流,提取时间分别为20,30,40 min;另3份超声,提取时间分别为20,30,40 min。结果表明,回流和超声两种提取方式对含量结果影响不大,因超声操作较为简便,且20 min能将马钱苷提取完全,故选择超声处理(功率 250 W,频率 49 kHz)20 min。

【参考文献】
    [1]中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准中药成方制剂,第7册[S].1993:93.

  [2]水彩红,曹 红.HPLC法测定山茱萸药材及六味地黄胶囊中马钱苷的含量[J].中国药品标准,2005,6 (4):17.

  [3]张先瑞.HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷的含量[J].国际医药卫生导报,2007,13(16):113.

  [4]赵新峰,孙 毓.胶束电动毛细管色谱法测定山茱萸中莫罗苷和番木鳖苷的含量[J].药物分析杂志,2007,27(8):1154.

  [5]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:附录VIB.


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