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高效毛细管电泳法检测生药龙胆中龙胆苦苷含量

来源:中国色谱技术网 作者: 2010-9-16
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摘要: 来源:中国色谱技术网摘要目的:建立高效毛细管电泳法测定生药龙胆中有效成分龙胆苦苷含量的方法。方法:毛细管区带电泳(CZE):运行电解质为含10%甲醇的20mmol/L硼砂缓冲液(pH10.6)。结果:测得龙胆苦苷的回归方程为y=0.0787+1.9981X(r=O.9998)。结论:本方法简便,准确,快速,重复性好。...


                                                          来源:中国色谱技术网

  摘要目的:建立高效毛细管电泳法测定生药龙胆中有效成分龙胆苦苷含量的方法。方法:毛细管区带电泳(CZE):运行电解质为含10%甲醇的20mmol/L硼砂缓冲液(pH10.6);工作电压18kV;柱温25℃;检测波长280IIm。结果:测得龙胆苦苷的回归方程为y=0.0787+1.9981X(r=O.9998);平均回收率为101%;RSD=2.64%(,l=5)。结论:本方法简便,准确,快速,重复性好。可用于龙胆中龙胆苦苷的测定。

  关键词:毛细管区带电泳;龙胆;龙胆苦苷

   龙胆为龙胆科植物,其药用部分的主要有效成分为龙胆苦苷,龙胆苦苷属环烯醚萜苷类化合物,有清肝解毒、消食健胃的功效。龙胆苦苷已被中国药典2000版作为龙胆HPLC方法含量测定的定量化学指标。目前国内外均未见HPCE分析龙胆苦苷的报道。为了扩展分析手段,据文献¨加以改进,采用CZE方法对生药龙胆中提取的龙胆苦苷进行测定。

  1、仪器与试剂

  1.1仪器:PA/CES000型毛细管电泳仪,紫外检测器,SystemGold软件,熔融石英毛细管柱(57cm×75μm,有效长度50cm)(Beckman美国),低温高速离心机(Beckman美国),超声仪(UhrosonicHomogenizer4710美国),分析天平(MettlerToledo瑞黑龙江省教育厅科学技术研究项目重大项目(955zzoo2)

  1.2试剂:龙胆苦苷对照品(纯度为98%,DELTA天然有机化合物信息中心安徽),内标氯霉素(Sigms美国),其它试剂为国产分析纯,样品(在黑龙江省泰康,牡丹江等地采集,由哈尔滨师范大学王臣老师鉴定)。

  2、方法和结果

  2.1实验方法

  2.1.1对照品及内标溶液的配制:分别精密称取适量的龙胆苦苷和氯霉素,甲醇溶解定量稀释制得。浓度分别为1.14mg/mL、0.545mg/mL。

  2.1.2样品溶液的制备:精密称取龙胆粉末0.1g,加入甲醇2mL超声处理40min后离心20000r/min5min,分取上清液用0.45pan滤膜过滤。

  2.1.3电泳条件:毛细管区带电泳(CZE):电解质为含10%甲醇的20mmol/L硼砂缓冲液(pH

  10.6);工作电压18kV;毛细管恒温25℃;检测波长280rim;样品压力进样5s(34kPa×S)。

  2.2实验结果

  2.2.1标准曲线的制备:精密量取龙胆苦苷对照溶液200,300,4OO,500,6OOμL,分别置1mL量瓶各加入内标溶液4OOμL,用甲醇定容至刻度摇匀,进行CZE测定。以对照品浓度(μg/mL)为横坐标,以对照品与内标物峰面积比值为纵坐标,进行线性回归,得到龙胆苦苷的回归方程为:Y=0.0787+1.9981r=0.9998由此可知,在内标浓度为0.545mg/mL时,龙胆苦苷含量在0.114-0.684mg/mL时线性关系良好。

  2.2.2精密度考察:取龙胆苦苷对照品溶液4O0μL置1mL量瓶加200L的内标溶液,加甲醇定容至刻度,连续进样5次,以峰面积比计算RSD为2.64%。

  2.2.3样回收率实验:分别取龙胆苦苷对照品溶液25,50,75,100,125μL,各加已知含量的样品溶液适量,按“2.1.2”项操作制备所需溶液,依次进样,测得回收率为101%。

  2.2.4样品含量测定:取样品溶液200置1mL量瓶加4OOμL内标溶液,加甲醇定容至刻度摇匀。依上述方法测定了4个不同品种的样品(n=3)。

  3、讨论

  3.1提取方法的选择

  本实验比较了3种不同的提取方法:①室温冷浸提取12h,时时摇动]。②37℃震荡提取12h。③室温超声提取40min。结果表明方法③提取的龙胆苦苷回收率最好,为101%,RSD=1.2%且节约时间。

  3.2电解质的选择

  实验先后采用了加10%甲醇的50mmol/L硼砂缓冲液和不加10%甲醇的50mmol/L硼砂的缓冲液,用0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHC1在9~10.6范围调节pH,结果发现加10%甲醇的50mmol/L硼砂的缓冲液(pH10.6)的测量结果虽然有明显的龙胆苦苷峰但未能与溶剂甲醇峰完全分离且加甲醇后峰形更好;将加10%甲醇的缓冲液中硼砂浓度降低至40mmol/L和20mmol/L分别考察其pH9~10.6的范围,发现当缓冲液中硼砂浓度为20mmol/L(pH10.6)时龙胆苦苷与溶剂峰完全分离且峰形较好。电解质确定为含10%甲醇的20mmol/L硼砂缓冲液(pH10.6)。

  3.3内标物的选择

  实验考察了多种可用的内标物,最后确定氯霉素为内标物,它在本实验条件下可与龙胆苦苷完全分离且迁移时间相差不到2min。

  4、结论

  本实验通过对不同电泳条件和电解质体系的优化及系统方法学的研究,建立了高效毛细管电泳测定生药龙胆中龙胆苦苷含量的方法。与高海等测定龙胆苦苷含量的HPLC方法相比本实验将样品的测量时间从近10min降至8min;本实验回收率101%与其回收率98.2%相比也有提高。通过对样品的提取方法的改进和测量时间的缩短使实验简便、快速,同时确保了良好的准确性和重复性。在本实验中测定的条叶龙胆(Gent/armmanshuricaKitag)、龙胆(GentianascarbraBge)、三花龙胆(GentianatrifioraPal1)、坚龙胆(Gent/anaFranch)4个品种中的龙胆苦苷的含量分为4.24%,1.28%,1.O9%,O.28%。


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