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指纹谱技术在中药材质量控制中的意义与作用

来源:www.sepu.net 作者: 2009-5-15

摘要: 中药的质量是其疗效的关键所在。随着现代分子生物学技术的发展,中药材指纹图谱技术在中药材质量控制中显示了越来越广阔的应用前景。(1)中药指纹图谱的概念和分类“指纹”(fingerpint)鉴定来源于法医学,每个人的指纹在微小的细节构造中各有不同,依据这些差异,通过“比对”方式,可以确定鉴别每个人的特征。随着生物技......


  中药的质量是其疗效的关键所在。长期以来,人们多是凭借经验,从药材的外观形态、气味以及一些简单的物理、化学现象来判断其真伪。虽然起到一定的作用,但常常有很大的主观性和片面性。随着现代分子生物学技术的发展,中药材指纹图谱技术在中药材质量控制中显示了越来越广阔的应用前景。

  (1)中药指纹图谱的概念和分类“指纹”(fingerpint)鉴定来源于法医学,每个人的指纹在微小的细节构造中各有不同,依据这些差异,通过“比对”方式,可以确定鉴别每个人的特征。随着生物技术的发展,提出了DNA指纹图谱分析,主要是通过DNA指纹图谱,对人、动物、植物等生命体进行鉴别鉴定,乃至亲子鉴定等,扩大了指纹分析的含义,其意义主要表现在两个方面:一是成为指纹图谱。指纹是以图像形式表现,而DNA指纹图谱是一些DNA片段所构成的条带图谱。二是分析目的有所扩展,既可以像指纹分析一样作个体“唯一性”的鉴定,又可以鉴别确定整个物种的“唯一性”(多个个体之间的共性),还可以用作亲子鉴定,即判断个体之间的亲缘关系等。中药指纹图谱则和DNA指纹图谱又有所不同。

  1)中药指纹图谱的概念:中药指纹图谱(fingerprinting)借用DNA指纹图谱发展而来,最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱,特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。HPLC具有很高的分离度,可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图,这些色谱峰的出峰位置和高度(或峰面积)分别代表了不同的化学成分和及其含量,整个色谱图表征了该样品所含化学成分的多少和量的大小。 

  如前所述,中药指纹图谱不同于法医学中的DNA指纹图谱。常规意义下的指纹强调的是绝对的“个体特异性”,据此可对任何犯罪嫌疑人指证和控罪。恰恰相反,中药指纹图谱赖以鉴别中药的药材真伪和质量优劣所要强调的却是作为药用植物物种的“共有特征性”。更值得指出的是,常规意义的“指纹”分析的依据主要是来源于先天的遗传,而中药药用化学成分的指纹图谱分析依据却主要来源于该植物物种后天的代谢产物,且大多为植物的次生代谢物。它对后天的生长环境的依赖性很强,远比纯先天性遗传的“指纹”脆弱得多,故有中药“道地性”和“最佳采集时间”之说。然而,植物的代谢过程仍受其物种先天遗传的影响,所以,利用中药药用化学成分的色谱指纹图谱是完全可以对不同药材种属进行鉴别,对同种药材质量优劣进行评价的。

  谢培山先生对中药色谱指纹图谱给出了以下定义:中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。借以鉴别真伪,评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。 

  2)中药指纹图谱的分类:狭义的中药指纹图谱是指中药化学(成分)指纹图谱。广义的中药指纹图谱则可按测定手段和应用对象进行不同的分类。 

  (ⅰ)按测定手段分类:中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。①中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。目前首推色谱方法和联用技术,使用最多的是用HPLC方法。②中药生物指纹图谱包括中药材DNA指纹图谱和研究中的中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱。中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药制剂作用于某特定细胞或动物后,引起的基因和蛋白的复杂的变化情况,这两种指纹图谱似可称为生物活性指纹图谱。目前,最主要和最常用的是中药化学指纹图谱,特别是中药HPLC指纹图谱。 

  (ⅱ)按应用对象分类:中药指纹图谱按应用对象来分类,可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细,还可包括用于生产工艺过程中间产物的指纹图谱。 

  中药材DNA指纹图谱主要用于测定各种中药材的DNA图谱。由于每个物种基因的唯一性和遗传性,中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究,它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。 

  中药材化学(成分)指纹图谱是指测定中药材所含各种化学成分(次生代谢产物),所建立的指纹图谱。虽然化学成分是次生代谢产物,受生物环境和生长年限的影响而产生个体间较为明显的差异,但植物的代谢具有遗传性,作为同一物种的个体在化学成分上也具有相似性(similarity),可以用化学成分的图谱来建立指纹图谱。中药材化学指纹图谱对控制中药材质量具有更直接、更重要的意义。 

  中药原料药指纹图谱应区别对待。对中药饮片指纹图谱的要求基本和中药材指纹图谱相同,对中药配伍颗粒(包括标准提取物)指纹图谱应要求高一点,应鼓励生产厂家采用标准提取工艺,严格控制工艺操作参数,并对原药材采取“混批勾兑”的做法,完全可以建立较稳定的指纹图谱,进行质量控制。 

  建立稳定的中药制剂化学指纹图谱,如果能实现将原药材投料改为提取物投料(可用混批勾兑做法),严格控制工艺流程,对生产工艺实现全过程指纹图谱监控,必定可以解决最终产品的质量稳定问题。 

  (2)中药指纹图谱的性质和作用中药指纹图谱应符合特征性、重现性和可操作性,才能满足指纹图谱的实用要求。 

  不论是中药材,还是中成药、中药方剂的中药指纹图谱,一定要能体现该中药(药材或复方)的特征,也可称为专属性或唯一性。当然也有可能用一张指纹图谱不足以表现其全部特征,而用几张指纹图谱来表现某种中药(药材或复方)的各个不同侧面的特征,从而构成其全貌,但对其中的每一张图谱仍应有其特征性(专属性)的要求。 

  指纹图谱主要是用来表现和控制中药的化学成分群的整体,故要有较好的重现性,因此根据不同的要求要考虑选用何种分析方法建立最合适指纹图谱。中药这样的复杂体系,基本特性之一是复杂性,其中包含了不确定度和一定的模糊性。这些问题和重现性的概念不同,可以在指纹图谱的数据处理中(如相似度的判断)采用适当的方法予以解决。 

  指纹图谱的可操作性系指针对不同用途,选用不同分析方法来达到不同的要求。如对于质量控制应考虑工厂和药检所常规配备的仪器设备来建立相应的方法,一般以光谱和气相色谱、高效液相色谱为主。对于用指纹图谱来进行配伍理论或新药开发研究,特别是化学成分和药理、药效相关性研究,就应考虑采用联用技术,如GC/MS、HPLC/DAD/MS/MS等方法,获取大量信息,更有利于得到明确的结果。即使对质量控制来说,对中间产品指纹图谱的要求,特别是相似度的判断上要求应比最终产品低一些。 

  (3)中药指纹图谱质控技术的应用中药产业发展到今天,中成药指纹图谱质控技术已是牵动行业全面进步的关键技术,其应用研究,对保证中成药功效,提高中药产业整体水平,带动中药农业现代化,推进中药走向世界,具有非常重要的现实意义。 

  1)指纹图谱质控技术在中成药现代化生产中的应用:尽管中成药在我国已有1700余年的历史,但由于受科学技术条件的限制,中成药在成品质量的控制上仍然缺乏科学的检验方法和手段,长期以来可谓“丸散膏丹,神仙难辨”。中成药功效的保证,主要依靠的是原料药材的道地性和药工制作的经验性。同仁堂“炮制虽繁,必不敢省人力;品味虽贵,必不敢减物力”的古训,集中反映了传统中成药生产保证质量的基点。虽然这种缺乏事后内在质量检验方法的状况,直到20世纪60年代徐国钧先生提出显微鉴别方法后才发生变化。但由于传统中成药蜜丸、水丸、散剂等主要剂型都以药材饮片粉末为制剂主料,又是小生产状态,所以,基本上可保证成药功效。 

  20世纪50年代以后,中成药剂型工艺到生产方式发生了根本的变化。片剂、颗粒剂、口服液等逐步取代了“丸、散、膏、丹”,制剂主料也由提取物取代原料粉;加之规模化、机械化生产方式的冲击,以及“为解决需求供应短缺,广泛引种药材”影响,靠“中药材的道地性、老药工的经验性”控制中成药质量的局面受到了冲击。要维持中成药功效的稳定性,就必须在建立现代化成品内在质量标准的基础上,予以严格的检验控制。随着科学技术的进步和植物化学研究的不断深入,将中药材研究已搞清的内在成分及其测定方法用于质量控制,制定相应检验标准,也有了长足的进步。以《中华人民共和国药典》为例,1963年版《药典》收载的中药材只有基原与外观形状鉴别,中成药则仅有处方与制法,没有任何检验项目。1977年版《药典》大量采用了显微鉴别。1985版《药典》开始,色谱、光谱技术在中药质量控制上被采用,应用的具体方法、技术、测定的成分和被要求的品种,都不断增加。最新的2000年版《药典》,收载含量测定的品种已达308种,把已知的主要成分或有药效的成分作为质控指标予以检测控制。  

  但是从中医药的观点看,个别单一指标成分的控制,难以真正控制中药功效。中医辨证施治用的是药味而非某个化学成分。麻黄碱与麻黄、甘草酸与甘草、人参皂苷与人参、天麻素与天麻等在中医来看是两件不同的事物。中药的“补气”、“活血”、“温里”、“发表”、“滋阴”、“健脾”等功效,是药材饮片或成药方剂内含物质群的整体作用结果。此物质群的整体情况,包括所含的物质数、物质量及组成比例差异,都会对功效发生影响。中药内含物质群是个很复杂的问题。就拿化学成分研究时间最长、研究资料积累最多的人参来说,现在已知人参含皂苷有30多种,挥发油29种,氨基酸15种,矿物质29种,糖类16种,有机酸11种以及酯类、生物碱、维生素、甾醇和多种酶等物质,而且还不断有新的发现。一味药材尚且如此,复方成药的物质群就更复杂了。 

  中医传统上有“传方不传量”之说,意即方剂功效不仅取决于构成方剂的药味,还取决于药味的绝对量及配伍比例。如张仲景伤寒论中的发表剂“桂枝汤”由桂枝、芍药、生姜、炙甘草、大枣5味药组成,仅仅把其中芍药用量加倍再加上饴糖,即成为补虚散寒,温建中脏(脾胃)的补益剂“小建中汤”。所以要控制中药功效,不能只针对某一二个化学成分,必须对方剂物质群整体予以控制。就此而言,要把质量控制建立在研究清楚每个内含成分的基础上,难以实现。这就要求提供一种在尚不清楚全体化学成分的情况下,实现对物质群整体控制的有效方法。而现代色谱、光谱等仪器分析所得物质群指纹图谱,展现了这种可能性。几个物质群在相同仪器、相同试验条件、相同操作方法下所得的指纹图谱相同性,即可反映这些物质群的同属性。虽然对图谱中每个特定峰的成分并不了解,也即对物质群的化学成分并不全知晓,但这并不影响对物质群一致性的判断。不仅可以定性鉴别,还可以半定量分析。面对形形色色的多组分体系,在充分利用化学测量仪器所产生的信号特点的基础上,运用信息学、统计学和计算机,最大限度地从中抽取不同特性样本中的定性、定量化学信息,为中成药指纹图谱建立,提供了现代科学技术基础,也使指纹图谱质控技术在中成药现代化生产中的应用成为可能。  

  2)指纹图谱技术在中药产业现代化中的应用:中药工业现代化归根结底要体现在其产品中成药的现代化上,中成药生产的现代化归根结底要体现在产品质量控制的现代化上。这种质量控制的要求,首先是指质量标准本身可以反映药效和安全控制,其次是指生产全过程可以控制达到成品内在质量的一致。而这两点正是当前中成药生产中最为突出的问题,不仅现有质量标准本身不足以控制成品功效稳定和安全,而且生产本身也难以保证成品的一致。所有这些又都是因为对成品的物质群差异状况本身就知之甚少。  

  指纹图谱质控技术的采用,有望显著改善中药的质量控制,带动产品质量标准的升级。而产品质量标准的升级,必然会影响到企业生产的各个方面。采用指纹图谱必然要求企业对原料内在质量批批测定,对原料仓储管理予以改进;必须要求对配方投料不仅仅是按处方投料,而且要针对同一味药、不同批号内在质量的差异,研究如何搭配投料以保证成品内在质量的相对一致;必然要求对工艺过程进行研究,确定严格的控制条件,以保证成品的一致性;必然要求改善生产岗位的管理,切实保证操作一致性,达到结果的一致性;必然要求对生产过程中的内在质量予以监控,研究相应技术对策,努力保证每个程序的出料符合要求,达到最终成品符合要求;必然要求对设备选型进行研究,改善设备保养管理,保证设备状态和使用的一致性。中成药的GMP在这时才更体现出“软件要求重于硬件要求的真谛”。  

  此外,指纹图谱质控技术的采用,也为各种新设备、新技术的应用提供了广阔的空间。指纹图谱与生产过程关系密切,可变因素多。一方面给指纹图谱一致性带来难度,另一方面正是因为有了指纹图谱质控要求,生产过程中工艺的变动、设备的变动是否合理在质量上有了客观的衡量标准。即可以在保证质量的前提下。大胆试验采用各种新工艺,新设备,而不是简单地要么都是醇沉工艺,要么都是大孔树脂工艺,要么一概排斥,盲目性很大。同样,中成药企业采用指纹图谱要克服许多技术和管理的障碍,但同时,也就在制定新产品的指纹质控图谱中自然包含了许多技术秘密。过去中成药处方是品种的技术核心内含所在,而今后光有处方,若不掌握生产工艺参数和设备,就不一定能够做出符合指纹图谱要求的产品。这时的指纹图谱就是企业新产品自我保护的技术壁垒。  

  指纹图谱质控技术的采用,不仅将有力促进中成药生产过程的量化操作,提高规范管理程度,促进生产过程的数字化控制,提高仪器与计算机的应用程度,促进新工艺设备的采用,提高工艺装备的现代化程度,而且还会为中成药新产品的研究开辟筛选新渠道。通过对同一处方,不同工艺,所得不同物质群图谱,比较功效差异,就可以筛选优化工艺技术。指纹图谱的技术难度和深度使之在推进中成药生产集约化、规范化的过程中,必将促进产业结构更加集中化,企业更加规模化。可以预见,如同当年中成药卫生标准引发了中成药企业的全面进步—样,中药质控指纹图谱的研究与应用在推进中成药产业现代化上必然起到更深、更广的导向与促进作用。  

  3)中药指纹图谱质量控制对中药农业现代化的促进作用:中药栽培在我国具有悠久的历史,早在2600多年前的《诗经》中就有具体体现。特别是20世纪后半叶,我国的中药栽培的发展出现了前所未有的局面,已相当大众化。直至现在家种家养药材已经基本满足市场需要。在此过程中,培养了一批中药材农艺科技人员,积累了一批中药材从育种、复壮到栽培、植保等方面的科技成果,但是从生产形式上看,中药农业至今基本上还是处于分散、落后的小农经济状态。价格波动大,药材质量波动亦大,而且药材质量比之过去反而下降。不仅是种植粗放问题,更有品种基原混乱、栽培地域混乱、收获时节混乱以及农药、化肥的滥用。再加上药材千年沿袭的集贸交易形式给制假、掺杂提供了机会,药材质量的参差不齐直接影响国内饮片与中成药质量,影响药材出口,造成出口数量的下降。 

  中药农业已到了必须重视质量,重视优势,讲究道地性的时候了。但中药农业是否重视质量,归根结底取决于中成药工业对原料质量的重视与否。中药工业近30年进步很大,如果说在发展中最滞后的环节是成品内在质量标准,那么最薄弱的环节则是原料采购。有的中药厂对原料质量不讲究,什么便宜进什么,导致了中药农业重数量不重质量的状况。现代中药产业药材、饮片、提取物、成药四大支柱,中成药的经济份额最大,药材的70%以上供应中成药厂,中成药工业已经处于中药产业的主体地位,对中药农业客观上具有主导作用。 

  建立药材基地,对工业企业和药农有供需稳定、价格稳定、生产稳定和质量稳定的好处。对产业来说,这充分体现出工业为主导,农业为基础。以现代化工业引导现代化农业,把现代化工业建立在现代化农业的基础上。只有这样才能保证中药工业现代化的持久稳定发展,也只有这样才有整体协调的中药现代化。可以说,没有中药农业现代化,就没有中药现代化,这方面一些企业已经有了成功的经验,如哈尔滨中药二厂在河北张家口的黄芩基地,天津天士力药业公司在陕西南洛的丹参基地,上海市药材公司在上海市郊的西红花基地等。中药指纹图谱的应用已经促使一些中药工业企业认真思考原料基地的问题,思考中药工业与农业的关系问题,思考中药农业与贯彻国策实现现代化的问题。由此可见,这项技术有牵动中药工业与中药农业共同实现现代化的作用,这种作用还刚刚开始,由此产生的工业生产规模化、集约化带动中药农业生产的集约化、规范化(GAP)和中药农业新的集中化、规模化、道地性,这种作用必将越来越显著。 

  4)国外中药指纹图谱质控技术的研究现状:近20年来,采用指纹图谱质控技术对中成药这样的物质群实施质量控制已成为世界各国的共识。如在20世纪80年代,日本汉方药主要生产企业在企业内部就已经采用高效液相指纹图谱技术控制生产质量。首先以按饮片配方煎煮得到的煎汁作为标准样品,测定指纹图谱,并以此为基础指导和监控生产过程。即采用传统方剂和道地药材,严格控制大生产的原料、配方和工艺,使成品指纹图谱与标准指纹图谱一致。欧洲一直比较重视草药的医疗作用。如德、法联合开发的银杏叶提取物EGb761就是一个典型的范例。他们对银杏叶提取物进行了长期的研究,发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果。把混合物所含内酯和黄酮相互分离,发现都不具备全部提取物整体的功效。最终得出EGb761提取物是一个“整体”,正是这样一种混合物保证了其所具有的治疗作用。这个结论和中医药整体观的认识是一致的,即中成药的疗效是物质群整体的功效。而对于这样一个“整体”的质量控制,也殊途同归,现在也是采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为这类混合物质群的质量控制方法。对用于治疗抑郁症的草药贯叶连翘的质量控制,也是一个很好的例子。1998年贯叶连翘产品从德国传到美国,使之成为了美国草药市场上令人注目的热点。美国采用指标成分金丝桃素含量作为其质量控制标准。但是,近年一些研究发现,此质控成分无抗抑郁作用,而德国公司一直采用指纹图谱整体控制技术,被认为更合理。 

  指纹图谱质控技术作为一项新技术,在学术界有一定的研究,在产业界却应用很少,用于中药生产尚有许多问题有待解决。特别是怎样将学术成果转化成产业界可实际应用的技术。只有科研、教育单位与生产、管理单位结合起来,学术界与产业界结合起来,共同努力,不断探索、加强交流、及时总结和完善,才能逐步建立起符合中药特色的指纹图谱质控技术体系。总之,以指纹图谱作为中成药、草药提取物质量控制方法,已经成为国际共识,中药界应该积极对待。要在消化吸收国际上这方面已有成果的同时,更注重结合中药的实际情况,广泛实践,及时总结,建立起符合中药特色的指纹图谱质控技术体系,与国际接轨。

  

  中药现代化是一个庞大的系统工程,涉及科、工、农、贸等多种行业。传统中药的特色和优势与现代科学技术的结合,特别是与生物技术的结合是中药今后赖以生存与发展的根本出路。相信在不久的将来,随着生物技术与其他高新技术广泛应用于中药领域,中药将会以“现代化”的崭新面貌,在世界生物医药产业中发挥越来越重要的作用。


 


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