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生化实验讲义(理论部分)四--电泳技术(一)

来源:中国仪器之家 作者: 2008-9-12
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摘要: 1 电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶......


4.1 电泳技术发展简史
      1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。
      1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
      1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
      1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。
      从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。
      1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。
      由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。
4.2 电泳的基本原理
      电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
      电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
      电泳装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm ? 14 cm,厚度为1mm~2 mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
      为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的,下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压(V),就会在电极中间产生电场强度(E),L是电极间距离。
      在稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F),等于所带净电荷与电场强度的乘积。
      这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F’的大小服从Stokes定律,即:
                 F’=6πrηυ
      式中r是球状分子的半径,η是缓冲液粘度,υ是电泳速度(υ= d / t,单位时间粒子运动的距离,cm / s )。当带电分子匀速移动时: F = F’,
               ∴  q•E = 6πrηυ
      由此可以看出,迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。

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