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中朝边境地区蜱中埃立克体DNA的分子流行病学调查

来源:中华医学研究 作者:张志强,吴益民,冯 立,王 昊,于 淼,王 卓作者单位 2013-9-26

摘要: 【摘要】 目的 了解中朝边境地区蜱感染埃立克体的情况。方法 采用16S rRNA基因特异引物进行半套式PCR,检测中朝边境地区蜱中埃立克体DNA。结果 从采集于黑龙江和吉林的全沟硬蜱中检出查菲埃立克体和人粒细胞埃立克体的特异性DNA片段,阳性率分别为3。采集于辽宁和吉林的森林革蜱中检测出查菲埃立克体特异性DNA片段,......


【摘要】  目的 了解中朝边境地区蜱感染埃立克体的情况。方法 采用16S rRNA基因特异引物进行半套式PCR,检测中朝边境地区蜱中埃立克体DNA。结果 从采集于黑龙江和吉林的全沟硬蜱中检出查菲埃立克体和人粒细胞埃立克体的特异性DNA片段,阳性率分别为3.04%和3.00%。采集于辽宁和吉林的森林革蜱中检测出查菲埃立克体特异性DNA片段,阳性率为1.68%。结论 中朝边境地区的全沟硬蜱和森林革蜱携带埃立克体,提示东北地区可能存在查菲埃立克体病的自然疫源地。

【关键词】  蜱;埃立克体;DNA;聚合酶链反应(PCR)

 Molecular epidemiology investigation on DNA of Ehrlichia in ticks in border region

  ZHANG Zhi-qiang , WU Yi-min, FENG Li , et al. Centre of Disease Prevent and Control of Shenyang, Shenyang 110034, China

  【Abstract】 Objective To get to know if there exists the infection on some of the ticks by Ehrlichia in north-east China.Methods Used the specific primers derived from the 16S rRNA gene sequence of E.Chaffeensis to amplify Ehrlichia DNA from the ticks through hemi-nested polymerase chain reaction. The PCR products were cloned and sequenced.Results Ixodes persulcatus and D.silvarum from north-east China were found to have specific DNA fragments of E.Cchaffeensis,the infection rate were 3.00% and 1.68% respectively. Chaffeensis Ehrlichia DNA were amplified from I. Persuleatus and D. Silvarum, it was intirely same in comparison of American strains(M73222)with 100% homology.Conclusion Ixodes persulcatus and D.silvarum from north-east area China were infected by pathogen of Ehrlichia.It indicates that there may have the nature foci of Ehrlichiosis in north-east China.

  【Key words】 tick;ehrlichia;DNA;PCR

  人类埃立克体病(Ehrlichiosis)是由埃立克体(Ehrlichiae)引起的一种新发现的蜱传人兽共患的自然疫源性疾病[1]。其病原体是革兰染色阴性,专性细胞内寄生菌,属立克次体科(Rickettsiaceae)埃立克体族(Ehrlichia)。目前世界上已有3种人类埃立克体病,即人类单核细胞性埃立克体病(HMG)、人粒细胞埃立克体病(HGE)及人类腺热。自1986年美国发现了HME,并于1991年在美国分离鉴定出该病的病原体[2]以来,在美洲、欧洲和非洲等地区不断有病例报道。

  1991—1992年李介芹等[3]用间接免疫荧光法证明了我国云南地区的军犬和健康人血清中存在查菲埃立克体。1999年以来高东旗等[4]和曹务春等[5]分别报道。

  从云南龟形花蜱和越原血蜱扩增出查菲埃立克体特异性DNA片段,从新疆的全沟硬蜱扩增出人粒细胞埃立克体特异性DNA片段。

  为了准确地对中朝边境地区人群及蜱种携带埃立克体情况进行调查,我们自1999年开始先后沿长白山山脉辽、吉、黑三省八个县市采集蜱标本,采用半套式PCR方法对标本中埃立克体DNA进行检测,调查其埃立克体携带情况,并对扩增产物进行克隆和序列测定,与GenBank中已知序列进行同源性比较,以了解中朝边境及相邻地区人群和常见蜱种是否存在与人类疾病有关的埃立克体。发现在中朝边境及相邻地区存在埃立克体DNA。现将研究结果报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 蜱标本来源 自1999—2001年每年的4~6月间,我们沿长白山山脉所涵盖的辽(清原)、吉(珲春、抚松、和龙、敦化)、黑(海林、穆棱、绥芬河)三省八个县市调查点,以布旗法采集游离蜱12419只,从家畜(牛、羊)的体表采集寄生蜱887只,从野外作业的林场工人及家属收工时体表上收集蜱126只。蜱种经鉴定后保存于液氮中。

  1.1.2 PCR引物 以查菲埃立克体和人粒细胞埃立克体16S rRNA基因部分序列作为埃立克体DNA检测的靶序列,设计埃立克体的特异性引物,由上海生工合成。其中HE1 和EC11为查菲埃立克体外引物,作第一轮扩增,然后用HE1和HE3作半套式PCR扩增,粒细胞埃立克体是以GE9f和GE10r作第一轮扩增,用GE9fr和PER2作半套式PCR扩增。

  查菲埃立克体引物:

  HE1: 5'-CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT-3' ;

  HE3: 5'-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT - 3';

  EC11: 5'- GACTACCAGGGTATCTAAT-3'。

  粒细胞埃立克体引物:

  GE9f : 5'- AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT - 3';

  GE10r: 5'-TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC - 3';

  PER2: 5'- CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT - 3'。

  1.1.3 其他试剂与仪器 Taq聚合酶及相应的PCR试剂为上海生工生物工程有限公司产品;扩增仪为PE公司产品。

  1.2 方法

  1.2.1 蜱标本DNA模板的提取 蜱标本按同种、同采集地、同采集时间1~5只为一组按参考文献[6]提取蜱标本DNA。

  1.2.2 半套式PCR检测 反应总体积为30μl,其中DNA模板3μl,引物浓度为0.8μmol/L,dNTP 100μmol/L。查菲埃立克体DNA检测以引物HE1和EC11扩增,扩增条件为95℃预变性3min,94℃ 60s,56℃ 75s,72℃ 60s 35个循环,最后72℃延伸7min。然后取上述扩增产物1μl 为模板,以引物HE1和HE3及同样的反应条件进行二次扩增。人粒细胞埃立克体DNA检测以引物GE9f和GE10r扩增,扩增条件为95℃预变性3min,94℃ 60s,52℃ 75s,72℃ 70s,35个循环,最后72℃延伸7min。然后用引物GE9f和PER2进行第二轮扩增,除将退火温度改为56℃外,其余扩增条件同第一轮。

  1.2.3 PCR扩增阳性结果判定 扩增产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳,有相应的埃立克体特异性DNA片段带为阳性。查菲埃立克体NDA是以引物HE1和HC11扩增出702bp的特异性片段再以HE1和HE3进行半套式PCR能扩增出389bp的DNA片段。人粒细胞埃立克体DNAS是以引物GE9f和GE10r扩增出918bp的特异性片段再以引物GE9f和PER2进行半套式PCR能扩增出589bp的DNA片段。

  1.2.4 PCR检测阳性率计算 分别取每一地区检测蜱标本总只数(n)和所分成的总组数求出组平均只数(m),以总组数和阳性组数之差并乘以组平均只数之积(R),代入概率公式P=1-(R/n)1/m,计算结果,换算成百分率。

  2 结果

  2.1 蜱标本中查菲埃立克体DNA检测结果 依据HE1、HC11和HE3引物分别从全沟硬蜱和森林革蜱中扩增出389bp的特异性查菲埃立克体DNA片段,而所采集的嗜群血蜱均为阴性,结果见表1。表1 中朝边境地区蜱标本查菲埃立克体DNA检测结果

  将检测结果代入概率公式P=1-(R/n)1/m,计算出上述地区全沟硬蜱和森林革蜱查菲埃立克体的阳性率分别为3.00%(1.39%~5.59%)和1.68%(1.28%~2.08%)。

  2.2 蜱标本中人粒细胞埃立克体DNA检测结果 依据GE9f、GE10r和PER2引物从全沟硬蜱中扩增出589bp的特异性人粒细胞埃立克体DNA片段,结果见表2。表2 中朝边境地区蜱标本人粒细胞埃立克体DNA检测结果

  将检测结果代入概率公式P=1-(R/n)1/m,计算出上述地区全沟硬蜱人粒细胞埃立克体平均阳性率为3.04%(2.00%~4.85%)。

  3 讨论

  我国与朝鲜相隔图们江和鸭绿江而相邻,是一条由东北至西南的边界,长约1600km。中朝边境地区地势险要,地形复杂,多属于长白山山脉的山地地形,属温带季风区,较暖而湿, 地理位置非常重要。植被以温带落叶阔叶林及针阔混交林为主,蜱种比较多,每年蜱活动高峰期都有不少因蜱叮咬而引起发热的病人,给驻军和当地村民及林业工人造成了严重影响。因此,调查研究该地区的蜱传疾病,及时做好预防和控制有着重要的现实意义。

  由于携带埃立克体的蜱种可由于地区的生态环境差异而各不相同,本研究采集中朝边境及相邻地区三省八个市县的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱等蜱种,应用埃立克体16S rRNA的特异性引物对蜱标本进行半套式PCR检测,对长白山林区4~5月份的优势蜱种携带的埃立克体进行了调查。

  结果从采集于黑龙江和吉林的全沟硬蜱中检出查菲埃立克体和人粒细胞埃立克体的特异性DNA片段,采集于辽宁和吉林的森林革蜱中检测出查菲埃立克体特异性DNA片段。

  研究结果表明在中朝边境地区全沟硬蜱和森林革蜱分布的区域可能存在着埃立克体病的自然疫源地,全沟硬蜱和森林革蜱可能是中朝边境地区埃立克体的主要携带媒介。

【参考文献】
   1 于恩庶. 新发现的传染病. 福州:福建教育出版社,1997:133.

  2 Anderson BE,Dawson JE,Jones DC,et al. Ehrlichia chaffeensis,a new species associated with Human ehrlichiosis. J Clin Microbiol,1991,29:2838.

  3 李芹阶,职宁,饶贤才,等. 从云南军犬及人群发现埃利希体抗体.中国人兽共患病杂志, 1993,9(9):33.

  4 高东旗,曹务春,张习坦,等. 应用半巢式PCR检测我国北方一些蜱种中的查菲埃立克体.中国媒介生物学与控制, 2000,11(3):64.

  5 曹务春,张泮河,张习坦,等. PCR检测蜱中查菲埃立克体DNA及其序列分析. 寄生虫与医学昆虫学报, 1999,6(1):58.

  6 曹务春,张泮河,张习坦,等. 人埃立克体感染分子蜱标本中病原体DNA检测 .中国公共卫生,1999,15(增刊):79.

  


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