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适合单采血浆丙氨酸氨基转移酶筛查的微量检测方法

来源:《中华医药杂志》 作者: 2009-8-24
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摘要: 【关键词】 单采血浆 丙氨酸氨基转移酶 筛查 微量检测方法 笔者通过对丙氨酸氨基转移酶筛查的微量检测方法进行改进,不仅减小实验误差,降低试剂成本,方便操作,降低劳动强度,而且保证了检测结果判断的准确性,更加适合单采血浆和输血单位对供血浆者(献血者)丙氨酸氨基转移酶筛查。 1 原理 血清中丙氨酸氨......


【关键词】  单采血浆 丙氨酸氨基转移酶 筛查 微量检测方法


    笔者通过对丙氨酸氨基转移酶筛查的微量检测方法进行改进,不仅减小实验误差,降低试剂成本,方便操作,降低劳动强度,而且保证了检测结果判断的准确性,更加适合单采血浆和输血单位对供血浆者(献血者)丙氨酸氨基转移酶筛查。

    1  原理

    血清中丙氨酸氨基转移酶在一定的反应条件下,作用于丙氨酸及α-酮戊二酸,生成一定量的丙酮酸及谷氨酸。2,4-二硝基苯肼能与反应产生的丙酮酸及剩余的基质α-酮戊二酸生成相应的2,4-二硝基苯腙。后者在碱性条件下呈棕色,从而推算出酶的活力。

    2  实验准备

    2.1  仪器、设备  雷勃10μl可调移液器;雷勃50μl连续分配器;722型分光光度计;全自动酶标测试仪(北京普朗);电子微量分析天平(分光度值为0.1mg以下);电热恒温箱;带盖空白酶标板(江苏海门市博阳实验器材厂生产)。

    2.2  试剂  四川迈克生产的丙氨酸氨基转移酶检测试剂。

    2.3  操作  用电子微量分析天平精确称取丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒内2mmol/L丙酮酸钠标准液0.438g,加入0.562g蒸馏水配制成0.876mmol/L浓度混匀,密封保存,作为25单位丙氨酸氨基转移酶对照品使用。

    2.4  样品测定  按表1顺序分别加入样品、标准试剂进行操作,为减少实验误差,标准孔加3孔,酶标仪取其平均值自动计算。表1  样品微量法测定操作过程

    2、4-二硝基苯肼溶液

    振荡1min左右混匀,室温静置5~10min,492nm测定波长,630nm参考波长下,空白孔调零进行酶标比色。读取各孔吸光度值A,大于标准孔读数的机器自动打印“+”,表示不合格;小于等于标准孔读数的机器自动打印“-”,表示合格[2]。

    2.5  结果判定  被测样本 :≤25单位为合格,>25单位为不合格。

    3  讨论

    本实验与已发表文献类似方法不同之处主要有以下几个方面:第一是先加基质,后加样品,目的是为了减少实验误差,因为经过实验证明对20份同样的样品进行检测,先加样品后加基质检测结果的变异系数达到13.2%,而先加基质,后加样品检测结果的变异系数仅有7.8%,原因可能是10μl的样品量太少,容易干燥导致检测结果不准确,基于本检测方法是终点法,作为采浆单位目的是为了筛查出不合格的供血浆者,保证原料血浆的安全性,所以采用先加基质,后加样品的实验步骤;第二是本方法不需要制作标准曲线,因为按照经典的赖氏法对28单位的定义:试管法为50μl 2mmol/L丙酮酸钠标准液,微量法所有试剂均为试管法加样量的1/10,5μl就相当于28单位,经过计算0.876mmol/L丙酮酸钠标准液10μl就相当于微量法的25单位。前提是在25单位到28单位成近似线形[1]。这样判断结果就变得非常简单:OD值比标准孔高的判断为不合格,反之合格。既保留原始打印资料方便今后查找,又节省90%的试剂成本,经过对1125样品用微量法和试管法同时检测,微量法检测结果为小于25单位(OD值为标准孔的0.8~1倍)但是经过试管法确定为大于25单位的有5例,不合格符合率达到99.6%,微量法检测结果为大于25单位(OD值为标准孔的1~1.2倍)但是经过试管法确定为小于25单位的有3例,合格符合率达到99.7%,解决办法是建立灰区范围(标准孔的0.8~1.2倍)用试管法确定。综上所述,该方法更加适合采集原料血浆前的样品筛查。

【参考文献】
  1 王日平.赖氏法测定血清ALT/GPT最佳标准曲线选择和计算.国际检验医学杂志,2006,27(6):封3.

2 边兴国.微量法与试管比色法检测ALT的比较. 微生物学免疫学进展,2004,32(4):39.


作者单位:四川成都,四川省金堂蓉生单采血浆有限公司检验部


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