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反相HPLC法测定9种薯蓣的皂素含量

来源:中华医药杂志 作者:肖冰梅,王朝晖,刘平安,李钟彭菲 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 比较9种薯蓣皂苷元含量的高低,以利于薯蓣属种质资源的科学采集、栽培和开发。方法 应用改良的反相高效液相色谱的方法,对9种薯蓣进行测定。结果 黄姜类的皂素含量普遍高于萆薢类。而块茎类薯蓣、日本薯蓣、黄独三种的含量最低,薯莨不含皂素。...


    【摘要】  目的  比较9种薯蓣皂苷元含量的高低,以利于薯蓣属种质资源的科学采集、栽培和开发。方法  应用改良的反相高效液相色谱的方法,对9种薯蓣进行测定。结果  黄姜类的皂素含量普遍高于萆薢类。而块茎类薯蓣、日本薯蓣、黄独三种的含量最低,薯莨不含皂素。结论  反相-高效液相测定方法快速准确,分离效果好,样品溶液能长时间保持稳定,重复性好。萆薢类的含量达到了1%以上,可以用于工业生产。

    【关键词】  反相HPLC;  薯蓣;   皂素

      Determination  on  content  of  diocosin  of  9  yams  by  RP-HPLC

    XIAO Bing-mei,WANG Zhao-hui,LIU Ping-an,et al.Department  of  Pharmacy,Hunan  College  of  Traditional  Chinese Medicine,Changsha 410004,China

    【Abstract】  Objective  Apply the improved method of RP-HPLC,carry on the measurement to 9 kinds of yams.Methods  Compare the content of dioscosin of more different category.For the convenience of Dioscorea resources  in collection,cultivation and development.Results  The plain content of dioscosin of Huangjiang  is widely  higher than  in Bixie .But the 3 kinds of yams’tuber is lowest,the Shulang does not contain the dioscosin.Conclusion  The method of RP-HPLC mutually quickly accurate,separate effective,the sample aqua can keep stable with long hours,repetition good.The content of Bixie comes to 1% above,can used for the industry production.

    【Key words】  RP-HPLC;   yams;   dioscosin

    薯蓣属植物为世界上提取合成激素类药物和避孕药的主要资源,其主要的有效成分为薯蓣皂苷元(皂素)。湖南省于1988年完成的最近一次中药资源调查中,发现本省薯蓣属药用植物资源较丰富,有一定的蕴藏量,大都含有皂素类成分。湖南省薯蓣属植物分布在衡阳、怀化、长沙、郴州、岳阳等地,有薯蓣(D. opposita Thunb.)、黄独(D.bulbifera L.)、绵萆薢(D. septemloba Thunb.)、盾叶薯蓣(Dioscorea Zingiberensis C.H.Wright)、细柄薯蓣(D.tenuipes Franch.et Sav.)、福州薯蓣(D. futschauensis Uline)、柴黄姜(D. nipponica Makino var rosthornii Prain et Burk.)、日本薯蓣(D. japonica Thunb.)、薯莨(D. cirrhosa Lour.)等九种;在民间分别用于补脾胃,平喘止咳,跌打损伤,止血活血,祛风利湿,解毒消肿。除盾叶薯蓣外,其他几种均未用于皂素原料的提取,仅限于民间治疗用药。资源的多样性没有得到充分、合理的利用。本研究根据薯蓣属在湖南省的资源分布情况,收集了2002年实地调查采到的9个品种野生种质,并在湖南中医学院药用植物园趋同栽培1年,对栽培1年后各品种薯蓣皂苷元平均含量进行测定,比较不同种类间的含量高低;以利于薯蓣属种质资源的科学采集、栽培和开发[1~9]。薯蓣皂苷元的含量测定,国内外报道的方法有多种,经典方法有:重量法、比色法、库仑法和薄层扫描法;现代方法有:气相色谱法、高效(正相,反相)液相色谱法以及毛细管气相色谱法等。经典的方法对仪器要求不高,但灵敏度低,分离效果差。由于此类皂苷的种类繁多,在各种薯蓣植物中的含量不一,因此经典的方法很难对薯蓣皂苷元准确测定。色谱的方法可以很好地排除相关物质的干扰,但由于薯蓣皂苷元沸点高,气相色谱条件要求苛刻,因此也不被普遍使用。本研究根据薯蓣皂苷元极性大的特点,建立了一套改良的反相高效液相色谱的方法,对薯蓣皂苷元进行测定。

    1  材料与方法

    1.1  材料的采集与处理

   分析材料取自于湖南中医学院药用植物园趋同栽培1年后的9个品种,2003年11月中旬取材,均为2年生根茎段,每品种取10个单株。60℃干燥至恒重,粉碎,过60目筛。

    1.2  薯蓣皂苷元分析与测定

    1.2.1  仪器与试剂

   高效液相色谱BF-KNAUER 高效液相色谱仪;K-501高压输液泵;K-2501紫外分光检测器;BF-2002色谱工作站;Scout 百分之一电子天平(梅特勒-托利多常州衡器有限公司);FA2104 万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂);所用化学试剂均为国产分析纯。CSF—1A超声波发生器(上海超声波仪器厂)。薯蓣皂苷元对照品由湖南正清制药集团正驰公司提供,纯度为99.2%;甲醇、95%乙醇、盐酸、氯仿均为色谱纯或分析纯。

    1.2.2  测定方法

    (1)液相色谱条件:色谱柱:江苏汉邦公司Lichrospher C18柱(150mm×4.6mm);带保护柱。甲醇—水(95:5)为流动相,用前以0.45μm微孔滤膜过滤,并经超声脱气处理30min。检测波长:209nm;灵敏度:0.04AUFS;流速:1.0ml/min;柱温:25℃。

    (2)标准曲线的制备:准确称取干燥后的薯蓣皂苷元对照品,用流动相溶解,制备成含量0.60、1.00、1.40、1.80、2.00mg/ml薯蓣皂苷元的系列标准溶液。按照所述的色谱条件将上述系列标准溶液各进样5μl,以薯蓣皂苷元的峰面积A对浓度c(mg/ml)进行回归,得回归方程A = 113996.56c-41782,r = 0.9996。结果表明在0.60~2.0mg/ml浓度范围内呈良好线性(见图1)。

    图1  薯蓣皂苷元标准曲线图

    (3)皂素提取方法优化:

  杨文远等经多种条件实验筛选和优化,认为在索氏提取器中用95%乙醇提取粉末至无色、2.0mol/L HCl回流2.5h水解后直接用氯仿回流萃取的方法,皂苷元产量高,精密度理想[10]。但此法耗时较长,笔者根据超声波的热效应、机械粉碎和空化作用,从超声提取时间、超声频率选择、超声与回流提取对比三个方面,对提取皂素的工艺进行了改良研究。实验证明超声提取方法具有省时、节能等优点,可以作为实验室和大生产的模拟工艺;在其余条件不变时,改用95%乙醇、300kHz超声提取30min,能够达到省时的目的(结果另文发表)。

    (4)样品制备:样品经干燥、粉碎后准确称取1g,置超声提取器中用60ml 95%乙醇提取1h。然后将乙醇提取液于旋转蒸发器中回收溶剂,残渣加20ml 2.5mol/L HCl加热回流2.5h。冷却溶液,用30ml氯仿分3次回流萃取,每次15min。合并氯仿萃取液于旋转蒸发器中回收溶剂,残渣用流动相溶解并定容为10ml,制成样品溶液,样品溶液经0.45μm有机滤膜过滤后供进样用。熔点测定用的样品制备依上述方法至蒸发浓缩得残渣,放冷,用石油醚洗2次,结晶在80℃烘干。

    (5)样品测定:

  在与对照品分析相同的色谱条件下,将样品溶液进样,每次5μl,由BF-2002色谱工作站处理谱图,结果见图2及表1、2。 图2  薯蓣皂苷元对照品HPLC图谱

    1.3  稳定性、回收率、精密度试验

    1.3.1  稳定性试验 

  取同一供试品溶液在1天内重复进样3次(2、4、6h),10天后再次进样,测定峰面积,计算峰面积的日内和日间相对标准偏差(RSD),考察其稳定性。

    1.3.2  回收率试验 

  精密称取同一批号样品3份,分别加入精密称取的薯蓣皂苷元对照品2mg,按上述步骤操作,定容至10ml,进样5μl测定,计算回收率。

    1.3.3  精密度试验

    取薯蓣皂苷元对照品,重复进样2μl 4次,测定峰面积,计算相对标准偏差(RSD),考察仪器的精密度。

    2  结果与分析

    2.1  薯蓣皂苷元含量及测定

    2.1.1  薯蓣皂苷元对照品分析  见表1。表1  薯蓣皂苷元对照品图谱分析由以上图表可知,薯蓣皂苷元的色谱峰保留时间在9.890′,前面的小峰是溶剂杂质峰;对照品的纯度为99.207%。

    2.1.2  样品含量及成分分析  (1)含量测定:  按1.1方法采集、处理样品;用已知浓度的薯蓣皂苷元标准溶液作标准,以外标法进行定量,测定了9种薯蓣中薯蓣皂苷元的含量。将用毛细管法测定结果见表2。

    以上数据说明,薯蓣皂苷元含量从高到低,依次为:盾叶薯蓣、柴黄姜、细柄薯蓣、福州薯蓣、绵萆薢、黄独、日本薯蓣、薯蓣、薯莨。药用部分为根茎的黄姜类(柴黄姜、盾叶薯蓣)与萆薢类(绵萆薢、细柄薯蓣、福州薯蓣)比较,黄姜类的皂素含量普遍高于萆薢类。而块茎类薯蓣、日本薯蓣、黄独三种的含量最低,薯莨不含皂素。与传统的民间分类基本符合。表2  湖南省薯蓣属植物药用部分皂素含量测定结果

    (2) 样品HPLC图谱分析:薯蓣样品地下部分甲醇提取液水解后的HPLC色谱图如图3。可见,所得谱图呈现分离情况良好,薯蓣皂苷元谱峰附近杂质峰较少,不干扰测定,效果最好。图3  薯蓣样品地下部分甲醇提取液水解后HPLC色谱图

    2.3  稳定性、回收率、精密度试验

    2.3.1  溶液稳定性试验 

  测定峰面积,计算峰面积的日内和日间相对标准偏差(RSD),分别为3.61%和6.5%,保留时间的变异系数分别为0.64%和1.15%。说明供试品溶液在所测期间基本稳定。

    2.3.2  回收率试验 

    精密称取同一批号样品3份,分别加入精密称取的薯蓣皂苷元标准品2mg,按上述步骤操作,定容至10ml,进样5μl测定,回收率为97%(n=3)。

    2.3.3  精密度试验  

   取薯蓣皂苷元标准品,重复进样2μl 4次,测定峰面积,计算相对标准偏差(RSD)为2.99%。保留时间为9.852min,RSD为0.73%。

    3  讨论

    (1)笔者根据超声波的热效应、机械粉碎和空化作用,对以薯蓣属植物为原料提取薯蓣皂苷的提取工艺进行了多因素的研究,证明超声提取方法具有省时、节能、提取率高等优点,可以作为;实验室和大生产的模拟工艺。本研究采用的超声提取薯蓣皂苷元和反相-高效液相测定方法快速准确,分离效果好,样品溶液能长时间保持稳定,重复性好。

    (2)虽然黄姜类的皂素含量普遍高于萆薢类,但是萆薢类的含量也达到了1%以上,可以用于工业生产。尤其目前黄姜资源濒临枯竭,萆薢类资源分布较广、资源量较充足,能有效补充皂素工业的需求。

    【参考文献】

    1  唐世蓉,张涵庆,庞自治,等.薯蓣科植物甾体皂苷元的含量和鉴定.植物学报,1979,21:171-176.

    2  Slack  SC,MEDER WJ.Colorimetric assey for diosgenin and related compounds.Analytical Chemistry,1961,33(4):  625-627.

    3  徐礼焱,刘爱茹.薯蓣属植物中薯蓣皂苷元的测定.药学学报,1984,19(2):141-145.

    4  陶莉,达晖宁,达世禄.盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的气相色谱测定.中草药,1991,22(6):252-253.

    5  ROZANSKI A.A simplified method of extraction of diosgen from Dioscorea Tubers and its determination by using gas-liquid  chromatography.Analyst,1972,97(11):968-972.

    6  赵景蝉,郭治安,成小飞,等.穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元的高效液相色谱法测定.药物分析杂志,2000,20(1):27-28.

    7  达世禄,唐祥伯,达晖宁.盾叶薯蓣中皂苷元的高效液相色谱测定.色谱,1992,10(2):98-99.

    8  都述虎,王晓华,夏重道,等.RP—HPLC测定穿龙薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元的含量.中国药科大学学报,2001,32(1):37-40.

    9  都述虎,王晓华,夏重道,等.穿龙薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元含量的毛细管气相色谱法研究.药物分析杂志,2001,21(2):116-119.

    10  杨文远,熊楚明.反相高效液相色谱法测定中药中薯蓣皂苷元.分析试验室,2002,21(1):74-75.

     *基金项目:湖南省科技厅资助课题(编号01NKY2021)

    作者单位: 1 410004 湖南长沙,湖南中医学院药学院

    2 510240 广东广州,广东药学院

  (编辑:余  强)


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