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金黄色葡萄球菌滤液制剂(思复胜)提升白细胞的实验与应用研究

来源:中华医药杂志 作者:任少华,胡定国,马凤森 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 观察金黄色葡萄球菌滤液制剂(思复胜)提升白细胞的作用。方法 对含有SEC的思复胜注射液进行动物体内提升白细胞、体外增殖淋巴细胞实验以及对少量肿瘤患者的临床应用研究。结果 采用含4ng/ml以上SEC思复胜注射液,均可刺激小鼠体内白细胞的显著升高(P<0。>5ng/ml剂量,可促进小鼠脾脏细胞及人外周血淋巴细......


    【摘要】  目的  观察金黄色葡萄球菌滤液制剂(思复胜)提升白细胞的作用。方法  对含有SEC的思复胜注射液进行动物体内提升白细胞、体外增殖淋巴细胞实验以及对少量肿瘤患者的临床应用研究。结果  采用含4ng/ml以上SEC思复胜注射液,均可刺激小鼠体内白细胞的显著升高(P<0.01)。>5ng/ml剂量,可促进小鼠脾脏细胞及人外周血淋巴细胞的高度增殖。其效果较ConA(阳性对照)更好。人体应用试验证明:含SEC 12ng/ml的思复胜注射液每日注射2ml,30天内可避免使放、化疗肿瘤患者外周血白细胞降低,且有一定程度的升高,与放化疗前相比,统计学上差异无显著性,而与未注射思复胜注射液的放、化疗对照组相比,其外周血白细胞减少差异有显著性(P<0.05)。含SEC的思复胜注射液可提升零星在家正在进行放、化疗肿瘤患者外周血白细胞数量,与已在放、化疗时白细胞数相比,其升高有显著(P<0.05)或非常显著(P<0.01)的差异。结论  含SEC的思复胜注射液对癌症放、化疗患者白细胞降低具有显著的保护作用。

    【关键词】  含SEC的思复胜注射液;提升白细胞;增殖淋巴细胞;肿瘤放、化疗

    Studies of experimential and application for Staphylococcus aureus cultures filtrate products(Si Fu Sheng)in promoting leukocytes

    REN Shao-hua,HU Ding-guo,MA Feng-sen.Lishui Central Hospital,Lishui 323000,China

    【Abstract】  Objective  The test for promoting of leucocytes on mouse in vivo and proliferating of lymphocytes on human and mouse in vitro and clinic applied on some cancer disease for si fu sheng products of contain SEC.Methods    There are some evidences that they can stimulate mouse in vivo leucocytes increasing remarkably.(P<0.01)by used si fu sheng at a dose of 4ng/ml(SEC) or more injection,while it deeply stimulating mouse spleen cells or human peripheral blood lymphocytes proliferation and differentiation by used a close of >5ng/ml(SEC) injection.Results  The effects are better than ConA(positive control).Clinic trials shows that they can hold back decrease of peripheral blood leucocytes of 31cases patients suffered from cancer after radiotherapy or chemotherapy,further more there are some increasing instead by injected si fu sheng 2ml/day with a dose of 12ng/ml (SEC). There are no statistical differences (P>0.05) compared with patients before radiotherapy or chemotherapy,but there are remarkable differences(P<0.05) between using and no using si fu sheng (31 cases patients) on peripheral blood leucocytes decrease.Peripheral  blood leucocytes number will step up to a remarkable(P<0.05)or highly remarkable (P<0.01)difference,for 12 cases piecemeal cancer patients with radiotherapy or chemotherapy takes si fu sheng 2ml/day injection compared with no using before.Conclusion  These studies manifest si fu sheng injection can pull leucopenia of a cancer patients with radiotherapy or chemotherapy up obviously.

    【Key words】  si fu sheng injection contain SEC;  promoting leucocytes;proliferating lymphocytes;  radiotherapy and chemotherapy of cancer.

    金黄色葡萄球菌滤液制剂是一种含有葡萄球菌肠毒素(SEC)的生物制品,而SEC又是一种外源性超级抗原(SAg)[1~4]仅需微量(纳克剂量ng)即可高效地刺激T细胞增殖。并促使机体释放多种细胞因子和产生细胞毒的作用[5~8]。体外细胞水平和动物体内水平的研究结果表明,作为SAg的SEC能够生产强大的杀伤或抑制肿瘤细胞效应[9~11],故是一种很有潜能的新型肿瘤免疫治疗剂,并展示了良好的应用前景。曾已发现SAg的适当浓度还能对小鼠脾脏细胞及人外周血白细胞的激活使之增殖的作用[12,13]。近年,因各种因素或肿瘤患者在进行放、化疗过程中,外周血白细胞大量被杀伤,致使体内白细胞高度减少,并可出现一系列不良反应,而含SEC的思复胜注射液却可增高各种原因引起的外周白细胞减少及缓解肿瘤患者因放、化疗引起的不良反应。笔者对此进行了实验研究,并对少数量的放、化疗肿瘤患者进行了临床试验治疗观察,获得了很有意义的结果,现将研究观察结果总结报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌株  金黄色葡萄球菌滤液制剂思复胜生产用菌株STMX91096,系冻干保存菌种。

    1.1.2  培养基  分离培养基采用优质营养琼脂平板和血平板,复壮培养基采用含人血   白蛋白、黏液素肉汤。种子和生产培养基采用猪心浸汁蛋白胨氯化钠培养基[14]。

    1.1.3  SEC的检测试剂  反向被动血凝试剂及SEC标准品购自北京中国人民解放军军事医学科学院流行病微生物研究所,批号020211。

    1.1.4  实验动物  昆明种小白鼠,购自浙江省医科院动物中心。

    1.2  方法

    1.2.1  金黄色葡萄球菌滤液制剂(思复胜)原液制备  按金黄色葡萄球菌滤液制剂全套方法制备[14]。所得过滤除菌液即为原液。

    1.2.2  思复胜原液中SEC含量测定  采用RPHA微量法测定原液中SEC滴度,同时与已标化的SEC标准品检测比较,以同批血凝试剂检测标准品(SEC)的敏感度(即ng/ml)乘于被检品的血凝滴度。即为被检原液中SEC实际含量(ng/ml)。例如用RPHA检测标准品敏感度为3.125ng/ml,而被检原液的血凝滴度为1:32,则原液中SEC含量为32×3.125=100ng/ml。

    1.2.3  试验用制剂的剂型制备  注射用针剂思复胜的配制:取注射用水配成氯化钠溶液,按所需SEC含量配制成不同SEC浓度的试验用稀释药液,灌封于50ml灭菌瓶中供试验用。人体试验用思复胜注射液,用注射用水配成pH6.7的氯化钠溶液,将原液按12ng/ml SEC稀释成半成品,再经过滤,按每安瓿2ml灌封,即为成品,再取样进行质量检查,合格者供人体试验用。

    1.2.4  动物体内升白实验方法

    (1)实验动物:系采昆明种小鼠,体重20g左右,雌雄各半,随机分组,每组10只。(2)实验方法:每次实验设正常对照组(NS)、环磷酰胺模型组(CTX)及给药组(不同浓度药液)。正常对照组连续5天腹腔注射NS。每天1次,每次每只0.2ml;CTX模型组,连续5天腹腔注射NS,每天1次,每次每只0.2ml;给药组连续5天腹腔注射被试药液,每天1次,每次每只0.2ml。至第3、4、5天,除正常对照组外。CTX模型组和给药组均加注CTX(1mg/ml),每天1次,每次每只0.2ml,末次注射后1h,取小鼠眼眶血20μl,用白细胞计数稀释液定量稀释后在计数板上显微镜下计数各小鼠白细胞数,用t检验分析每组小鼠白细胞数,并与CTX模型组比较计算P值。

    1.2.5  动物脾脏淋巴细胞及人外周血淋巴细胞增殖实验参照[15,16]MTT比色法进行。

    1.2.6  思复胜注射液对肿瘤放、化疗患者的临床试验观察方法  系由丽水市中心医院呼吸科及普外科进行。所有病例均为术后或已丧失手术机会即将进行放、化疗的恶性肿瘤患者,无放、化疗禁忌证,共62例。男35例,女27例,年龄19~77岁。随机分试验组和对照组,每组31例。(1)试验组(放、化疗联合思复胜组):在接受放、化疗同时,应用思复胜肌肉注射,每天1次2ml,连续30天为1个疗程。(2)对照组(单纯放、化疗组):按常规应用放、化疗,不用任何药物作辅助治疗。疗程与试验组同。(3)所有患者放、化疗前检查外周血白细胞数及其他指标,放、化疗过程中每周复查白细胞,至第4周再检查1次,并对所有的白细胞数据作统计学处理。

    2  结果

    2.1  含不同量SEC的思复胜注射液在小鼠体内升白的比较实验使用不同含量SEC(2、4、8、10、15、20ng/ml)思复胜注射液分2次6组进行了小鼠体内增白实验,每组各10只小鼠。每次同时作正常对照组(NS)和CTX模型组对比实验。结果见表1、表2。

    表1  思复胜中SEC不同含量(2、4、8ng/ml)实验结果  (略)

    表2  思复胜中SEC不同含量(10、15、20ng/ml)实验结果  (略)

    从表1、表2可见,当药液中SEC含量大于4ng/ml时(包括4ng/ml),对小鼠均有显著或非常显著的提升白细胞的效果。而<4ng/ml,如3ng/ml则未能显现升白作用。

    2.2  思复胜注射液对小鼠脾脏细胞的增殖实验  以拉颈处死昆明种小鼠,剖腹用无菌操作取出小鼠脾脏,镊碎、研磨和洗涤后,用RPMI1640培养基将其调正至1×106/ml脾脏细胞悬液。在96孔灭菌细胞培养板中进行实验,每孔均加脾脏细胞悬液100μl;阳性对照6孔每孔加ConA 100μl(浓度为10μg/ml)。试验分3组,每组6孔加不同浓度含SEC药液(5、10、20 ng/ml)100μl,混匀后封板置37℃,5%CO2培养箱内培养70h,再对所有孔加50μl MTT溶液,续培养4h,用比色机测每组每孔OD570mn值,并计算6孔均值。试验结果见表3。

    表3  思复胜中不同SEC含量对小鼠脾脏细胞增殖实验结果(略)

    可见思复胜注射液中SEC 5ng/ml或以上浓度,即能促进小鼠脾脏细胞增殖,其增殖效果与ConA(阳性对照)相当或更高。

    2.3  思复胜注射液对人外周血淋巴细胞的增殖实验  取肝素抗凝正常人外周血,以Ficoll分层溶液和密度梯度离心法制备人外周血淋巴细胞悬液,并调正至1×106/ml,按上述同样方法进行人外周血淋巴细胞增殖实验,结果见表4。

    表4  思复胜中不同SEC含量对人外周血淋巴细胞增殖实验结果(略)

    从表4结果可见,思复胜注射液中SEC 5ng/ml以上对人外周血淋巴细胞同样具有促进其显著增殖的效果。

    2.4  思复胜注射液对肿瘤放、化疗患者的临床试验观察

    2.4.1  含SEC思复胜注射针剂的临床试验观察  使用含SEC的思复胜针剂(12ng/ml)对31例试验组(放、化疗联合应用思复胜针剂注射)和31例对照组(单纯放、化疗)患者进行试验,放、化疗前及放、化疗后1~4周,每周取末梢血作白细胞计数。观察两组患者外周血白细胞的变化情况,并作统计学处理,结果见表5。

    表5   两组患者外周血白细胞变化情况  (略)

    从表5结果可见应用含SEC思复胜针剂注射的试验组,经放化疗1个月未见白细胞数下降,且均有少量升高,与放化疗前相比白细胞计数差异无显著性(P>0.05)。而对照组放、化疗后白细胞数量显著下降,且与放化疗前差异有显著性(P<0.05)。

    2.4.2  对零星癌症患者思复胜注射液的辅助治疗作用观察  从2003年2月~2004年10月,分别随机选取12例零星已在家进行放、化疗的癌症患者,在放化疗的同时,加思复胜注射液每天2ml作辅助治疗,观察思复胜注射液辅助治疗对患者外周血白细胞的变化情况,方法是对正在进行放化疗的患者先做1次外周血白胞计数,随后每天注射思复胜1支(2ml),此后每周做1次白细胞计数。每例患者均观察4周,结果见表6。

    表6  思复胜注射液对零星正在进行放、化疗癌症患者外周血白细胞变化情况(略)

    从表6可见,正在进行放化疗患者白细胞高度降低,当用思复胜辅助治疗后,12例患者外周白细胞都有显著升高,且差异均有显著性或非常显著性。

    3  讨论

  因某些环境因素的影响或肿瘤患者手术后在进行放、化疗过程中,可使机体内白细胞被杀伤,从而导致血液中白细胞高度减少,并可呈现各种疾病或出现不良反应。一般均用升白药物进行治疗,可使外周血白细胞有一定程度升高。但目前所用升白药物其升白作用并不持久,一般于24h后逐渐降低。而作为SAg的SEC可通过特异性抗原的模拟性识别而产生强大的T细胞刺激作用。由于抗原识别功能的相似性及T细胞的多克隆化[17]。因此,作为SAg的共同特点具有超常的效应作用,其最大效应出现在注射后的24h,并能持续48或72h,才逐渐下降,这就显示出含SEC的思复胜注射液刺激增白作用要比目前一些沿用制剂更有其优越性[18]。业已证明,SAg刺激T细胞增殖,其剂量在1~10ng/ml时,即可诱导出最大应答。而10pg/ml就可诱导测出的增殖反应。因此,SEC刺激淋巴细胞增殖能力要比ConA要好。肿瘤患者由于自身疾病的影响以及手术后的创伤,本身免疫力就很低下,特别在进行放、化疗时,可导致白细胞高度减少,这是由于疾病的损害、治疗的创伤、治疗后副作用,更使免疫功能降低,抑制骨髓功能,严重影响了患者的生存率和生存质量。而SEC作为一种免疫激活剂、生物反应调节剂及肿瘤生物治疗剂,它不仅能提高机体的总体免疫水平,还能杀伤或抑制肿瘤细胞,修复损伤组织和细胞。因此,从我们的试验中已经证明:含4ng/ml以上SEC制剂,可促进小鼠体内白细胞的显著升高;而5ng/ml以上可使小鼠脾脏细胞和人外周血淋巴细胞增殖。再从临床患者在放、化疗过程中,使用含SEC的思复胜制剂,不论是住院治疗患者或零星在家治疗的癌症患者,均已显示出可使被应用者外周血白细胞显著升高,免疫功能增强,这就可以防止放、化疗过程中对机体免疫功能的损伤而出现的一系列反应。此对肿瘤患者在进行放、化疗过程中免遭白细胞减少而出现多种反应的防治是有现实意义的。在对升高白细胞分类试验中笔者还发现,用思复胜制剂导致白细胞升高,不仅仅是淋巴细胞,而对中性粒细胞和单核细胞也有同比例上升现象。因此,笔者认为思复胜制剂不仅仅能使用于因肿瘤患者放、化疗期间对机体免疫系统的保护,也可用于那些因环境因素作用或其他免疫功能低下人群所引起白细胞减少的一系列疾病的防治。

    【参考文献】

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    17  雷祚荣.细菌毒素分子生物学.北京:中国科学技术出版社,1993,88-93.

    18  Hedlund G,Dohlsten M,Petersson C,et al,Superantigen based tumor;In vivo activation of cytotoxic T-cell. Cancer Immunother,1993,36:89-93.

     (编辑:石  岚)

    作者单位: 1 323000 浙江丽水,丽水市中心医院
2 310018 浙江杭州,杭州国光药业有限公司


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