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快速斑点免疫渗滤试验诊断日本血吸虫病的初步研究

来源:中华医药杂志 作者:傅行礼,姜旭淦,仇锦波,陈盛霞,徐会娟,帅连云,曹 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 探讨快速斑点免疫渗滤试验(FDIFA)诊断日本血吸虫病的实用价值,寻找适用于该实验的最佳诊断抗原。方法 (1)分别制备日本血吸虫雌、雄成虫及虫卵粗抗原与组分抗原,并预制成抗原片。(2)采用FDIFA和常规ELISA法分别检测血吸虫病患者血清33份,健康人血清32份,肝吸虫病、肺吸虫病及猪囊虫病患者血清各5份,......


  【摘要】  目的  探讨快速斑点免疫渗滤试验(FDIFA)诊断日本血吸虫病的实用价值,寻找适用于该实验的最佳诊断抗原。方法  (1)分别制备日本血吸虫雌、雄成虫及虫卵粗抗原与组分抗原,并预制成抗原片。(2)采用FDIFA和常规ELISA法分别检测血吸虫病患者血清33份,健康人血清32份,肝吸虫病、肺吸虫病及猪囊虫病患者血清各5份,比较了日本血吸虫雌、雄虫及虫卵抗原的敏感性和特异性。(3)以χ2检验作统计学处理和分析。结果  日本血吸虫雌、雄成虫及虫卵的组分抗原用于FDIFA,其敏感性好于粗抗原,且特异性亦较好;同时,雄虫抗原好于雌虫抗原,虫卵抗原好于成虫抗原,但它们之间并差异无显著性(P>0.05)。结论  日本血吸虫卵组分抗原用于FDIFA诊断日本血吸虫病,具有较好的敏感性和特异性;但抗原分离、纯化方法及实验过程仍需进一步优化。

  【关键词】  日本血吸虫;  快速斑点免疫渗滤试验(FDIFA);  ELISA;  组分抗原
 
  Preliminary study on diagnosis of schistosomiasis japonicum by fast-dot-immunofiltration assay

  FU Xing-li,JIANG Xu-gan,QIU Jin-bo,et al.

  Department of Parasitology,school of Medical Technology,Jiangsu University,Zhenjiang 212001,China

  【Abstract】  Objective  To explore diagnostic effect of schistosomiasis japonicum by fast-dot-immunofiltration assay(FDIFA) and look for optimal antigens to diagnose this disease.Methods  The rough and fractional antigens of male and female and egg of Schistosoma japonicum were prepared. FDIFA and routine ELISA were applied to detecting patient serums of 33 schistosomiasis and 32 healthy controls and other parasitoses (15 cases). Compared the sensitivity and specificity of these antigens.Results  All fractional antigens have good sensitivity and specificity.Conclusion  Fractional antigens of egg of Schistosoma japonicum may be applied to diagnosis of schistosomiasis.FDIFA was a good method for diagnosis of schistosomiasis.

  【Key words】  Schistosoma japonicum;FDIFA;ELISA;fractional angtigens;ELISA

    日本血吸虫病(以下简称血吸虫病)分布广泛,危害严重。近年来由于受多种因素影响,我国江湖洲滩地区有螺面积时有增加,人群感染血吸虫人数明显增多,疫情仍呈上升趋势。传统的病原学方法和常规免疫诊断技术在诊断病人、监测疫情和大规模流行病学调查方面难以适应血防工作的需要。因此,研制简便、快速、准确、价廉,便于在疫区推广应用、具有普查、临床实验诊断和疗效考核价值的检测方法是当前搞好血防工作的前提条件之一。

  常规ELISA法自20世纪70年代开始应用于血吸虫病诊断,具有较好的敏感性和特异性。但因操作步骤多,实验时间长,且需要一定的设备,故较难在基层和现场推广使用。为了提高ELISA检测速度,更便于基层及现场调查时使用,笔者根据ELISA的实验原理和本室在测姜片虫病时的免疫学方法[1],稍加改进,建立了快速斑点免疫渗滤试验(Fast-dot-immunofiltration assay,FDIFA),应用于血吸虫病的实验诊断,并与常规ELISA法作比较,取得了初步效果。现报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  血清来源 

  (1)33份血吸虫病患者(均粪便孵化阳性)血清均由湖南省血吸虫病防治研究所提供。(2)32份健康人血清采自本校2004年入学体检的非疫区新生。(3)肝吸虫病、肺吸虫病及猪囊虫病患者血清各5份,均由中国疾病预防控制中心寄生病预防控制所提供。所有血清均置-20℃保存备用。

  1.2  主要试剂

  1.2.1  硝酸纤维素膜(NC,孔径0.25μm),为Schleicher & Schuell产品。

  1.2.2  辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(HRP-Protein A;HRP-SPA)由美国进口,工作浓度为1:10000。

  1.2.3  四甲基联苯胺(TMB.2HCL)为Sino-American  Biotechnology  Co产品,由上海华美生物工程公司供应。临用前1h配制:先将5mgTMB.2HCL加入1ml二甲亚砜(DMS)液中溶解,然后加入50ml0.05M pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,再加入25μl 30%H2O2,混匀。

  1.2.4  封闭液为含1%BSA的pH 7.0 PBS-Tween20(TBS)缓冲液,现配现用。

  1.3  血吸虫抗原的制备

  1.3.1  动物模型的建立 

  成年新西兰家兔10只,以常规方法感染1000条日本血吸虫尾蚴,于感染后42天剖杀,采用门静脉灌注法收集成虫。新鲜活虫立即用生理盐水漂洗3次,然后分别收集雌、雄虫。采用朱明东等[2]改进的虫卵分离新方法[2],自兔肝获得纯净日本血吸虫虫卵,并收集、分装在洁净离心管内,置-20℃保存备用。

  1.3.2  血吸虫雌、雄虫和虫卵粗抗原的制备 

  取雌虫450条、雄虫320条、虫卵0.8g,分别置匀浆器内(冰浴)匀浆15min;再置冰浴中超声粉碎,频率1500Hz,每次3min,间歇1min,共5次。然后置冰箱冷冻室,反复冻融3次;最后于4℃下离心(10000转/min)1h,上清液即为粗抗原。经UV-210紫外分光光度计280/260nm波长测定,计算出各蛋白浓度分别为0.034mg/ml、0.044mg/ml、0.026mg/ml,分装置-20℃备用。

  1.3.3  血吸虫组分抗原的制备 

  (1)取雌、雄虫和虫卵粗抗原各1.5ml,分别沿管壁缓缓加入层析管(纤维素层析柱),使纤维素与抗原物质之间形成界面混匀状态。(2)待粗抗原渗入层析柱后,再用0.0175mol/L pH 6.3缓冲液不断滴入层析管,进行洗脱。(3)层析管下端用华氏试管收集洗脱液,每管收集3ml,每种抗原各收集18管。(4)测定3组各管内洗脱液的OD值,分别得出3个峰值;各收集峰值前后OD值较高的2~3管洗脱液混合,即可获得雌、雄虫和虫卵3种纯化组分抗原。通过SDS-PAGE和Western blot分析,组分抗原含有粗抗原的主要免疫反应成分,去除了多数与日本血吸虫免疫无关蛋白(待发表)。(5)经岛津UV-210紫外分光光度计280/260nm波长测定,计算出各组分蛋白浓度分别为0.034mg/ml、0.044mg/ml和0.026mg/ml,分装后置-20℃保存备用。

  1.4  快速斑点免疫渗滤试验

  1.4.1  稀释抗原 

  用pH9.6 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释3种抗原,其中雌、雄虫组分抗原稀释至2μg/ml;虫卵组分抗原稀释至0.5μg/ml。

  1.4.2  NC圆片制作 

  用内径0.7mm的打孔器将NC片切割成小圆片,在蒸馏水中浸泡1h,取出晾干。

  1.4.3  抗原片制作 

  用6个等大的大头针柄分别蘸取6种稀释抗原,印滴在硝NC正面的中央,点样直径为1.7mm,晾干后备用。然后,将晾干的NC小圆片浸于封闭液中2h,晾干后即为抗原片。试验前,用细胞培养板作载体,将抗原片贴在该自制的FDIFA反应板孔中的垫料上,孔内垫料为吸水性强的纸质。再用双面胶将抗原片贴于中央带有1.3mm小圆孔的橡胶垫圈,然后置于细胞培养板孔中垫料的上面(贴紧),置-20℃保存备用。

  1.4.4  用细滴管在抗原片上滴加pH7.0 TBS,每片3滴,逐一缓滴,置28~30℃1min(下同)。

  1.4.5  按序号将1:10的稀释血清50μl滴加在抗原片上,待干。

  1.4.6  用细滴管在抗原片上滴加pH7.0 TBS,每片3滴,逐一缓滴,洗涤。

  1.4.7  用移液器将1:10 000酶标结合物,每片50μl,待渗入。

  1.4.8  用细滴管向抗原片上滴加pH7.0 TBS,每片3滴,逐一缓滴,洗涤。

  1.4.9  用移液器在抗原片上滴加50滴底物溶液,待5min。若硝酸纤维素膜的中央出现灰蓝色斑,即为阳性;而无色或仅为极淡蓝色斑,则为阴性。

  1.5  酶联免疫吸附试验

  1.5.1  稀释抗原 

  用pH9.6 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释3种抗原,其中雌、雄虫组分抗原稀释至2μg/ml;虫卵组分抗原稀释至0.5μg/ml。

  1.5.2  包被酶标反应板  用稀释过的3种抗原各100μl分别包被酶标反应板,平放湿盒内(密封,下同),置4℃下8h。

  1.5.3  取出反应板,弃去包被液,用含1%BSA的pH7.0 TBS100μl封闭,4℃下过夜。

  1.5.4  弃去封闭液,用pH7.0 TBS洗涤液冲洗3遍,甩干。然后,于每孔加入1:100稀释样本血清,每孔100μl,并设阳性、阴性和空白对照,置37℃孵育1h。

  1.5.5  弃去样本液,用pH7.0 TBS冲洗3遍,拍干。加1:10 000酶标结合物(HRP-SPA),每孔100μl,置37℃孵育1h。

  1.5.6  以上法冲洗、甩干后,加入现配制的底物,每孔100μl,置暗盒(密封),室温下15min。

  1.5.7  目测结果 

  若出现蓝色反应则为阳性。深蓝色为+++,明显蓝色为++,淡蓝色为+;无色或极淡蓝色则为阴性。

  1.5.8  机测结果 

  每孔加50μl 2mol/L H2SO4终止反应,用DG-3022酶联免疫检测仪测定结果。样本OD值≥阴性对照2.7倍即判为阳性。

  2  结果

  2.1  6种抗原检测的敏感性 

  见表1、表2。表1  6种抗原用于FDIFA的敏感性比较(略)注:*χ2测验结果:P>0.05,差异无显著性 表2  6种抗原用于常规ELISA检测的敏感性比较(略)注:*χ2测验结果:仅雌虫组分抗原与粗抗原之间差异有显著性(P<0.05)

  用FDIFA检测血吸虫病人血清33份,雌虫、雄虫、虫卵3种粗抗原检测的阳性符合率分别为91%、94%、94%;3种组分抗原检测的阳性符合率分别为94%、97%、100%。同时,用ELISA法检测上述血清,结果3种粗抗原检测的阳性符合率分别为76%、94%、94%;3种组分抗原检测的阳性符合率分别为61%、97%、100%。表明FDIFA法略优于ELISA法。

  2.2  6种抗原检测的特异性

  2.2.1  6种抗原用于FDIFA的特异性比较

  用6种抗原检测32份正常人血清,结果除雌虫组分抗原试验组显示3例(9.38%)假阳性外,其余5种抗原试验组均出现4例(12.50%)假阳性反应。

  2.2.2  6种抗原用于ELISA的特异性比较 

  用6种抗原检测32份正常人血清,结果均出现3例(9.38%)假阳性反应。

  2.2.3  6种抗原检测其他寄生虫病人血清 

  采用FDIFA法和ELISA法分别用6种抗原检测肝吸虫、肺吸虫及猪囊虫病人血清各5份,结果均出现1例(20%)交叉反应,即特异性为80%。因例数太少,很难说明问题。

  3  讨论

  在血吸虫病防治工作中,寻找简易、快速、准确,既具有疗效考核价值,又能用于疫情监测的免疫学诊断方法,是一个迫切需要解决的问题。以往,在常规免疫学诊断中,多以粗抗原进行试验,故特异性不尽如人意。据报道,有人对部分现有血吸虫病诊断试剂进行测试,结果都有不同程度的交叉反应或假阳性出现,尤其是与肝吸虫病、肺吸虫病、猪囊虫病之间的交叉反应更甚,因而导致部分病例被误诊,耽搁了诊断和治疗[3,4]。

  本研究表明:FDIFA的敏感性略好于常规ELISA,雄虫抗原好于雌虫抗原;而虫卵组分抗原则是最好的抗原,此与文献报道相一致[5]。在用ELISA法检测时,雌虫组分抗原的敏感性明显低于粗抗原,二者之间差异有显著性(P<0.05);在应用雌虫粗抗原或组分抗原进行试验时,FDIFA的敏感性则明显好于ELISA法,二者之间亦差异有显著性(P<0.05)。

  FDIFA与常规ELISA有相似的敏感性和特异性,不过却大大简化了操作步骤。全部操作过程可在10min内完成,且取材简便,成本低廉,无需特殊设备,其敏感性也有所提高,特别适合于基层和现场使用,具有较好的推广价值和发展前景。至于在用该法进行试验时,与其他寄生虫病(如肝吸虫病、肺吸虫病、猪囊虫病)之间存在交叉反应现象,其特异性略逊于ELISA法,既表明本法更为敏感,亦提示在其实验环节上亟待改进;同时,抗原分离、纯化方法和实验过程亦有待进一步优化。然而,按敏感性≮90%、特异性≮80%;Yauden指数(特异性/敏感性或敏感性+特异性-1)≥0.70即符合免疫诊断要求的一般规定,FDIFA法仍不失为一较好的免疫学诊断方法。

  【参考文献】

  1  仇锦波,邵英远,傅行礼,等.斑点免疫渗滤试验诊断姜片虫病的研究.临床检验杂志,1994,12(3):150.

  2  朱明东,洪玲娣,卓敏敏,等.日本血吸虫虫卵分离方法的改进.中国血吸虫病防治杂志,1998,10(3):170-171.

  3  汪世平,曾宪芳,甘定祥,等.日本血吸虫虫31/32Kda分子抗原快速诊断试剂盒的研制与现场应用.中国血吸虫病防治杂志,1999,11(6):333-335.

  4  秦志强,曾庆仁.日本血吸虫病免疫诊断的研究进展与问题.中国寄生虫病防治杂志,2001,14(4):306-308.

  5  华万全,朱荫昌,何伟.日本血吸虫虫卵组分抗原的分析.中国血吸虫病防治杂志,1997,11(2):82.

  基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(01KJB310012)

  作者单位: 1 212001 江苏镇江,江苏大学医学技术学院寄生虫学教研室

  2 200009 上海,中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

  (编辑:黄杰)

 


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