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实时荧光定量PCR在乙型肝炎诊断中的临床价值探讨

来源:中华医药杂志 作者:巫小萍 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 探讨定量HBV-DNA与HBV其他标志物(HBVM)及乙肝前S1蛋白(Pre-S1)检测间的关系,正确评价其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对360例血清HBVM阳性患者进行HBV-DNA检测,并且还对其中162例HBsAg、HBeAg、HBcAb(即1。5)阳性三种乙肝感染模式的患者进行Pre-S1同步检测。5两种乙肝感染模式应用FQ-PCR......


  【摘要】  目的  探讨定量HBV-DNA与HBV其他标志物(HBVM)及乙肝前S1蛋白(Pre-S1)检测间的关系,正确评价其临床意义。方法  采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对360例血清HBVM阳性患者进行HBV-DNA检测,并且还对其中162例HBsAg、HBeAg、HBcAb(即1.3.5)阳性和HBsAg、HBeAb、HBcAb(即1.4.5)阳性及HBsAg、HBcAb(即1.5)阳性三种乙肝感染模式的患者进行Pre-S1同步检测。结果  对1.3.5和1.5两种乙肝感染模式应用FQ-PCR检测HBV-DNA与进行Pre-S1检测,差异无显著性(P>0.05),但前者阳性率(96.92%、63.63%)高于后者(94.00%、50.00%);而在1.4.5感染模式中HBV-DNA与Pre-S1检测结果比较,差异有显著性(P<0.05)。结论  实时荧光定量PCR技术所检测的HBV-DNA是目前临床诊断乙肝感染与复制及观察疗效的可靠指标。

  【关键词】  FQ-PCR;Pre-S1;乙型肝炎;HBV-DNA

  乙型肝炎(HBV)是威胁我国人民健康最重要的传染病之一。自1965年Blumberg发现HBsAg以后,HBV的研究就揭开了序幕。1983年由美国Cetus公司Kary B Mullis发明了聚合酶链反应(PCR)技术,短短几年,PCR就以其灵敏度高、特异性强的特点,广泛应用于HBV感染的研究和诊断。1995年美国PE公司又对实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术研制成功。由于这种技术具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性,且定量动态范围高达十个数量级。因此,近年来,FQ-PCR对HBV的研究又重新拉开了帷幕,研究正在向纵深发展。本文也采用FQ-PCR对江西萍乡地区360例乙型肝炎患者进行了HBV-DNA检测分析,并就FQ-PCR在乙肝检测方面的临床价值作一探讨。

  1  资料与方法

  1.1  检测对象  360例肝炎患者均为我院传染科住院和门诊病人,年龄6~72岁,平均31岁。临床诊断符合1995年病毒性肝炎防治方案标准[1]。空腹取患者3ml血液,分离血清置-20℃冰箱备用。

  1.2  检测方法

  1.2.1  主要试剂  FQ-PCR试剂盒由上海复星公司提供,探针序列在S基因区,上游引物5′-CTCGGATCCTTGTGACTTCTTTCCTG-3′;下游引物5′-CGGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCT-3′;乙肝病毒标志物(HBVM)五项试剂盒由上海科华生物技术有限公司提供;Pre-S1试剂由中科院上海生化所提供。

  1.2.2  SLAN荧光定量PCR检测系统  由上海宏石医疗科技有限公司生产;SM-3酶免仪、DEM-Ⅲ酶标洗板机由北京航宇浪琴医疗设备有限公司生产。

  1.2.3  FQ-PCR工作原理  利用Taq酶的5′→3外切酶活性在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5′端标以荧光发射基团FAM,靠近3′端标以荧光淬灭基团TAMRA,探针的3′端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时,淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离,抑制作用被解除。518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交,延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动,当移动到探针切断,淬灭作用被解除,荧光信号释放出来。

  1.2.4  统计学处理  采用χ2检验

  2  结果

  360例3种感染模式(1.3.5;1.4.5;1.5)的患者血清标本经FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性(指:检出浓度>1.0×103为阳性,<1.0×103为阴性)率分别为96.92%、16.88%、63.63%;同步检测Pre-S1的阳性率分别为94.01%、33.85%、50.00%(见表1)。

  表1  血清HBV-DNA与HBVM及Pre-S1检测结果比较(略)

  3  讨论

  FQ-PCR是在常规PCR基础上加荧光标记探针来实现其定量功能的,其特异性强、灵敏度高,并采用对数期分析,摒弃终点数据,定量准确,同时仪器在线式实时监测,结果直观,避免人为判断。而过去常规PCR如电泳法和反向膜杂交法只是对扩增产物采用终点法分析,无法实现定量检测,且阳性率较前者低。本文资料显示,应用FQ-PCR检测萍乡地区乙肝1.3.5组和1.5组HBV-DNA阳性率(96.92%、63.63%)明显高于1998年江西萍乡巫小萍等[2]反相膜杂交法(定性)检测HBV-DNA阳性率(89.50%、39.10%),可见FQ-PCR其灵敏度高是显而易见的,它将替代以前常规PCR。

  表1中乙肝1.3.5组和1.5组HBV-DNA阳性检出率与Pre-S1阳性检出率无明显差异,(χ21.3.5=0.49,P>0.05;χ21.5=0.01,P>0.05),结果提示,HBV-DNA与HBV基因前S1区编码的产物即Pre-S1两者相关极为密切,但前者的阳性率高于后者这一事实,又说明Pre-S1不能替代HBV-DNA的检测,而且,FQ-PCR HBV-DNA仍然是目前检测乙肝的最可靠的依据。

  附表中乙肝1.4.5组HBV-DNA阳性检出率只占16.88%,明显低于天津孙秀凤等(64.7%)[3]的文献报道(χ2=49.97,P<0.01),但与1998年江西萍乡巫小萍等(19.3%)[2]的文献报道一致(χ2=0.17,P>0.05)。这一现象提醒我们:对萍乡地区乙肝1.4.5感染模式HBV-DNA检出率如此低的原因,还很有必要在今后的工作中再做深入的分析研究。

  表1中乙肝1.4.5组HBV-DNA阳性检出率(16.88%)与Pre-S1阳性检出率(33.85%),差异有显著性(χ2=5.89,P<0.05)。结果提示:Pre-S1作为HBV前S1区编码的蛋白分子,有它自身的半衰期,不同亚型的HBV所产生的Pre-S1会不同,其半衰期的时间也会各不一样,所以本文认为,以前把Pre-S1作为一种反映病毒复制情况的标志与HBV-DNA的作用等同起来还值得商榷。

  【参考文献】

  1  病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志,1995,13:241.

  2  巫小萍.PCR杂交流法对HBsAg阳性药品从业人员的检测结果探讨.江西医学检验,1998,16(3):135-136.

  3  孙秀凤.乙型肝炎病毒前S1蛋白与乙肝E系统及HBV之间的关系探讨.江西医学检验,2005,23(1):49-50.

  (编辑:若  木)

  作者单位: 337000 江西萍乡,萍乡市第二人民医院

 


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