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凝集抑制试验快速测定循环免疫复合物

来源:中华医药杂志 作者:徐志毅 2006-8-19

摘要: 【摘要】 目的 推荐一种操作简便、快速的常规定量测定循环免疫复合物的方法。方法 用多株类风湿因子(pRF)乳胶凝集法定量测定血清中免疫复合物。结论 本法不需特殊分析仪器,操作简便迅速,重复性及稳定性好,是临床常规定量测定循环免疫复合物的使用方法。循环免疫复合物 Rapid determination of circulatory immune c......


  【摘要】  目的  推荐一种操作简便、快速的常规定量测定循环免疫复合物的方法。方法  用多株类风湿因子(pRF)乳胶凝集法定量测定血清中免疫复合物。结果  共测定30例健康献血员和各种病人200例。正常人的平均含量为79.43±1.95μg/ml,系统性红斑狼疮病人的平均含量为526.4±2.28μg/ml,该值显著高于正常人对照组(P<0.01)。结论  本法不需特殊分析仪器,操作简便迅速,重复性及稳定性好,是临床常规定量测定循环免疫复合物的使用方法。

  【关键词】  多株类风湿因子;快速;定量测定;循环免疫复合物
  
  Rapid determination of circulatory immune complex from inhibitive agglutination test

  XU Zhi-Yi.

  Health School Affiliated Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092,China

  【Abstract】  Objective  To introduce a rapid and easy method of routine quantitative  determination of circulatory immune complex.Methods  Quantitative determination of immune  complex in serum from inhibitive agglutination test with polystrain rheumatoid factor (pRF)  emulsion.Results  Determination was carried out from 30 healthy persons and 200 various cases.  Average value of normal people is 79.43±1.95μg/ml and that of systemic lupus erythematosus (SLE) sufferers is 526.4±2.28μg/ml which is evidently higher than that of normal people(P<0.01).Conclusion   With this  method of determination no special analytical apparatus is needed. It is easy to master and can  give results rapidly. Besides, it shows good repeatity and stability and provides a practical means  of clinically determining circulatory immune complex routinely.

  【Key words】  polystrain rheumatoid factor;rapidity;quantitative dermination;CIC

    免疫复合物(IC)系指由抗原与其相应抗体结合而成的复合体。正常情况下,体内IC的形成可清除异物,起到有利的免疫保护作用,但在某些情况下,也可导致免疫复合物病。其关键除机体因素外,也取决于IC的大小和溶解度。体内形成的IC一般有3种形式:一是大的IC(>19s),可被吞噬细胞吞噬去除;二是中等大小的IC(约19s),往往易沉着于局部导致组织损伤;三是小的IC(<19s),即循环免疫复合物(CIC),游离于血液、体液中,其存在和含量变化对免疫复合物病的诊断、病程动态观察、疗效及某些疾病机制的探索等方面都有一定价值。
CIC的测定方法很多,文献报道已逾40种,但都不能同时符合特异、灵敏、简便、重复性好的要求。目前国内常用的聚乙二醇(PEG)沉淀试验,方法虽简单,但灵敏度低、特异性差、影响因素多[1]。因而需要建立一个适用临床,既敏感又快速简便的方法。为此,本文按国外报道有关方法的原理[2],建立了多株类风湿因子(pRF)乳胶凝集抑制试验。现将方法与结果报道如下。

  1  材料与方法

  1.1  主要器材  Sephadex G200玻璃层析柱(100cm×1.25cm)、部分自动收集器、LKB记录仪(瑞典LKP)、免疫化学自动测定仪(美国Bechman)、黑色反应板、微量加样器等。

  1.2  主要试剂  二硫苏糖醇、IgG致敏的聚苯乙烯乳胶、pH8.2氨基醋酸缓冲液、pH4.0,0.1mol醋酸缓冲液、pH8.4Tris-Hcl (含1.5molNacl) 缓冲液、Sephadex G200、pRF[3]、热凝聚IgG[4~6]。

  1.3  检测对象  健康献血员30例、住院病人200例。

  1.4  试验原理  类风湿因子(单株或多株)是抗变性IgG的抗体,能与IgG的Fc段结合。此结合并非由于IgG暴露了新的抗原决定簇,而是因某些原因造成IgG分子相互集聚,产生了抗原的多价性,促进了RF的结合[7]。因此,类风湿因子能与复合物中的IgG、人工凝聚的IgG和致敏于胶乳的IgG起反应,而不能与单体IgG或其他免疫球蛋白的复合物反应。本法就是利用多株类风湿因子与IgG致敏胶乳反应可被血清中的免疫复合物和热凝聚IgG所抑制而建立的。

  1.5  标准品的建立  凝聚IgG在理化形状和免疫学活性等方面均与免疫复合物相似,是国际公认[8]的循环免疫复合物检测的标准品。本法也用其作检测标准。

  按棋盘格法,将pRF和热凝聚IgG进行一系列稀释滴度,选最小的热凝聚IgG和pRF出现凝集抑制(即无凝集现象)作为实用单位。如以5u/ml的pRF受10μg/ml AHG抑制作为实用单位,则试验所用的pRF均用pH8.2氨基醋酸缓冲液稀释成5u/ml,标本不凝集的效价乘10即为免疫复合物的相对含量(μg/ml)。

  1.6  试验方法  待检血清行一系列稀释,取稀释血清50μl分别置黑色反应板各格中,再加50μl经pH8.2氨基醋酸缓冲液稀释的pRF(按具体情况确定实用单位),充分混匀作用数分钟后加入50μl升IgG致敏胶乳,混匀作用3min后观察结果。

  若待检血清RF阳性(即有内源性RF),则须将血清处理后再测CIC,以免造成假阴性。去除内源性RF的方法很多,最简便的是二硫苏糖醇(DTT)法[2]:血清标本加二硫苏糖醇至1.3毫克分子并立即塞上塞子,5min即可破坏内源性RF的凝聚活性,然后去塞45min,使剩余的二硫苏糖醇全部氧化后即可使用。

  1.7  结果判断  出现凝集表示不含免疫复合物,不凝集(即凝集抑制)则证实标本中有免疫复合物。

  不出现凝集的血清最高稀释倍数×实用单位的AHG量(μg/ml)= CIC(μg/ml)

  2  结果与讨论

  2.1  临床测试结果  共检测健康献血员30例及各种病人血清标本200例,其结果见表1。

  表1  各组CIC结果 略

  2.2  重复性与稳定性  取混合血清按本法同时进行20次免疫复合物定量测定,变异系数为4%,可见该方法重复性好。将血清分别置-20℃、4℃及室温(20℃左右)用本法定期测免疫复合物含量,发现-20℃ 2个月、4℃ 1个月及室温1周内结果无变化,与国外报道的相似[2]。

  2.3  各试验间的相关性  随机抽取16份血清标本,同时用聚二乙醇沉淀试验、抗补体试验及本法测定免疫复合物的含量。结果显示pRF胶乳凝集抑制试验与抗补体试验结果间有密切的关系(r>r0.05,P<0.05)。造成相关性不够理想的原因可能是和复合物的大小、组成、性质及补体反应能力等有关。有人认为,各试验所测的CIC之间有着质和量的差别[13]。见表2。

  表2  各试验结果间的相关性 略

  2.4  关于方法学  众所周知,循环免疫复合物的测定方法众多,但各有欠缺。1981年WHO国际免疫学会曾统一推荐[9]固相或液相C1q法、固相胶固素结合试验、Raji细胞放射免疫法、单株或多株类风湿因子抑制试验等方法。有人认为[10],目前循环免疫复合物的测定方法中最敏感的是固相胶固素结合试验和Raji细胞放射免疫法,其次是C1q结合试验和固相mRF抑制试验。但作为理想的循环免疫复合物测定法,除了要有高度的敏感性外,还须具备相对特异性、检测范围广、重复性好、简便、适用于常规应用等条件。前3种的共同特点是只能测较大的免疫复合物(检测小的CIC更有意义)和依赖补体的免疫复合物,且需要同位素的特殊检测仪等。此外,固相胶固素结合试验仅对C3b的短寿命中间片段C3bi敏感,所测的循环免疫复合物就更局限,且EDTA和含乙胺酰基的糖类会抑制胶固素的反应。Raji细胞法需维持细胞株,且细胞培养条件对结果影响很大,难以做到标准化。死的Raji细胞可释放核抗原、胞浆,会导致假阳性。血标本中若有抗淋巴细胞抗体或抗补体抗体也可导致假阳性,过量补体可抑制该反应。C1q法不能检测IgG4及旁路激活补体的免疫复合物,另外C1q对DNA及其他多聚阴离子物质非常敏感,试验中干扰因素较多,而且C1q含量少,不易精制和保存。至于单株类风湿因子(mRF),其虽敏感度高、受内源性RF干扰小,但mRF很难获得。可见上述方法作为常规测定均有不同的缺陷,而pRF胶乳凝集抑制试验恰恰能弥补以上方法之不足,且敏感性与它们相比毫无逊色。

  多株类风湿因子(分子量约100万)主要属于19sIgM,是类风湿性关节炎、各种胶原性疾病及多种慢性疾病时出现的一种多株性变性IgG的自身抗体与循环免疫复合物和热凝聚IgG的亲和力很高,与单体IgG几乎不结合。与单株类风湿因子相比更具取材方便的优点。本法的敏感性较高(<10μg/ml)、重复性好(变异系数为4%)、稳定、且可测大至19s以上,小到8s的免疫复合物,后者更是胶固素、Raji细胞、C1q等敏感方法所不能及的。此外,作为常规测定法,本法更具有不需特殊设备、操作简便、成本低、不必考虑补体因素,适于大批量标本检查等优点。然而,其也非十全十美,某些因素的存在有时会影响试验的结果。

  2.5  影响因素  部分病人血清中存在内源性RF会干扰试验,因而须将其去除才能提高检出的阳性率。国外有不少去除内源性RF的方法,如二硫苏糖醇(DTT)法及亲和层析法[2]、2-巯基乙醇法[5]等。本文采用的二硫苏糖醇(DTT)法虽简便,但仍无法避免IgG型RF造成的假阴性。

  尽管RF一般与单体IgG的亲和力极小,但由于Ig类别不同,RF的抗体活性也很不均一,因此不同的RF在与CIC反应时,可受单体IgG不同程度的抑制。当血清中有大量单体IgG并存时,所选择的RF对聚合的IgG(包括AHG和CIC)亲和力越高,则受单体IgG的干扰越小,试验的敏感性与特异性越高。换言之,试验的特异性与敏感性是受所选择RF的影响[7]。pRF法的另一不足是不能检出IgG型以外的CIC。另外,当室温下降(15℃)时,pRF试验反应较慢,可能会影响结果的判断。为了获得准确的结果,每次试验要同时做阴性和阳性对照。

  2.6  关于正常值  我们对30例健康献血员进行了免疫复合物定量测定,平均含量为79.43±1.95μg/ml。有报道[13]5个实验室同时用pRF测定40例正常人,其平均含量为83.6±7.56μg/ml,可见结果相近。正常血清中存在着微量凝聚IgG。国外学者[2]也认为正常血清中存在非特异性抑制因子。本法所测IC量可能包括上述物质,然而本文以≤正常X+2SD为正常值,所测各病例的结果与临床诊断有较好的一致性。

  2.7  临床价值  我们共测200例各种疾病的血清标本,并用健康献血员作对照,其结果与临床诊断相符、与国外报道相近[11]。

  慢性肝病组包括慢性肝炎、慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌病人,其平均含量为437.0±2.22μg/ml,阳性率为42.5%。肾炎的平均含量为499.4±2.22μg/ml,阳性率为46.5%。红斑狼疮的平均含量为526.4±2.28μg/ml,阳性率为50%(国外报道[13 14]为56%)。其他结缔组织病包括硬皮病、干燥综合征、皮肌炎等,其平均含量为655.8±2.56μg/ml,阳性率为45%。该四组的结果均显著高于正常人(P<0.05),可能类风湿关节炎患者血清中IC并不高(关节滑液中IC较高[12]),也可能是因本法不能检出IgG以外的IC而造成的假阴性。其他疾病包括骨折、上呼吸道感染等病例的平均含量为130.2±1.68,CIC无一阳性,与正常人差异无显著性(P>0.05)。结果说明本法对慢性肝病、肾炎、红斑狼疮等疾病的诊断有一定价值。实验中还发现内源性RF和CIC在病程中有交替出现的倾向,证实了国外的报道[2]。

  总之,pRF胶乳凝集抑制法具有血清用量少、重复性好、成本低、敏感、稳定、简便、能测不同大小的CIC等优点。该法不失为简便可行、灵敏稳定的CIC常规定量法。

  【参考文献】

  1  唐观甜. PEG沉淀试验检测IC的一些影响因素探讨.上海免疫学杂志,1982,2(6):13.

  2  冯慧敏.免疫复合物与免疫复合物病. 国外医学·免疫学分册,1981,4(5):225.

  3  Daniel P.Stites . Medical immunology.9th ed. Appleton and Lange,1997,63-72.

  4  Langone J J. Immunochemical techniques. Immunol,1981,74:519.

  5  Cowdery J S J.Immunol. Immunol,1975,114:5.

  6  孔宪涛,叶天星,谢映华,等. 临床免疫学技术.上海:第二军医大学附属长征医院,1980,240-241.

  7  陈敬贤.利用类风湿因子或抗抗体进行IC测定的方法. 国外医学·免疫学分册,1983,6(6):301.

  8  Janeway CA.Immunbiology:the immune system in health and disease. 4th ed.New York:Current Biology Publications,1999,339-361.

  9  Report of an IUIS/WHO working group.Clin Exp Immunol,1981,46(3):662.

  10  Zubler RH. Detection of immune complexes in human diseases.Prog.Allergy,1978,24:1.

  11  J. Bradley and J.McCluskey.Clinical immunology,3th ed.Oxford: Oxford University press,1997,330-348.

  12  Janeway CA.Immunobiology:the immune system in health and disease.4th ed.New York:Current Biology Publications,1999,490-509.

  13  陈敬贤. 循环IC检测的影响因素-特异性敏感性. 国外医学·免疫学分册,1982,2(1):39.

  14  Janeway CA.Immunobiology.4th ed. New York:Current Biology Publication,1999,22-78.

  作者单位: 200092 上海,上海第二医科大学附属卫生技术学院

  (编辑:罗  彬)


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