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中药质量控制方法之一———中药指纹图谱

来源:中华医药杂志 作者:黄青萍,蔡 乐,滕茜华 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 通过论述中药的特点、发展方向,阐明采用中药指纹图谱控制中药质量的意义和必要性,简述中药指纹图谱的研究现状。中药指纹图谱。研究现状 人类文明进步和科技发展,使人们越来越关注生活的质量,尤其是与健康和长寿有关的医疗和保健消费,许多人从被动取药、按方吃药到现在主动询问用药方法、注意药品主治、禁忌......


  【摘要】  通过论述中药的特点、发展方向,阐明采用中药指纹图谱控制中药质量的意义和必要性,简述中药指纹图谱的研究现状。

  【关键词】  质量控制;中药指纹图谱;研究现状

    
  人类文明进步和科技发展,使人们越来越关注生活的质量,尤其是与健康和长寿有关的医疗和保健消费,许多人从被动取药、按方吃药到现在主动询问用药方法、注意药品主治、禁忌证、服药注意事项以及有效期等,同时对中药及中成药的毒副作用也有新的认识,药品的质量越来越受到重视。

    1 中药的特点和发展方向

    1.1 中药的特点 中医处方均以药味入药,常常配伍组方,且大部分中药的有效成分不完全明确,其中已知的有效成分往往不能代表其中药的全部疗效。由于中药来源复杂,同名异物、同物异名等现象非常普遍,同一品种由于其生态环境、栽培条件、采收时间、采收地点、加工炮制、贮存条件等的不同其有效成分会有差异,在剂量上、用法上的不同疗效也会不同,给质量控制带来困难。

    1.2 中药的发展方向及制订中药质量标准的意义 中药及其制剂大体上经历了以药效作为监测指标的传统剂型、以生物利用度作为监测指标的近代剂型、以最佳血浓度作为监测指标的现代剂型和以靶向和控释作为监测指标的未来剂型的四个发展阶段。随着时代的发展,中药剂型必须向既符合中药制剂的特点,又符合当代快节奏的生活方式方向发展。因此建立和完善符合中医药特点和国际认可的中药质量标准,并使之逐步推广到世界天然药物研究和开发中,是推动中药现代化的重要基础工作。

  2 中药指纹图谱

    2.1 中药指纹图谱的特性 中药指纹图谱是以系统化学成分研究的药理学研究为基础,结合先进的分析测试、数学统计手段以及计算机模拟方法学,将中药的特征和有效成分以图谱的形式描绘出来,以反映中药所含成分的种类和数量,从而进行真伪识别、种间识别等,以确定其质量和疗效。具有特征性、专属性、可量化性、稳定性、重现性、再现性、有效性、完整性和指纹图谱细节处理的模糊性等特点 [1] 。

    2.2 中药指纹图谱的研究方法 近年来中药指纹图谱的研究方法有:薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(EP)、气相色谱法(GC)、紫外光谱法(UV)、RAPD技术等,目前指纹图谱分析现已成功应用于人参、地黄、桑白皮、蒺藜、蟾蜍、蛇胆等动植物中药材鉴定和分类,用于中成药处方分析和含量测定,也取得良好效果。
 
  3 中药指纹图谱的研究现状

    3.1 薄层色谱(TLC)指纹图谱 TLC即用固定波长对薄层展开的各斑点做薄层扫描,扫描的图谱比目测的层析图谱更为客观准确,具有较好的指纹鉴别意义。乔春峰等 [2] 对闭鞘姜、莴笋花和光叶闭鞘姜根茎进行生药性状、组织显微和薄层色谱鉴别,通过薄层色谱定性,表明闭鞘姜和莴笋花均含有薯蓣皂苷元,而光叶闭鞘姜根茎则不含,为该类药材的鉴别和质量标准提供依据。张雪荣 [3] 将1年生白芍(断面直径在0.5cm以下)、2年生白芍(断面直径在0.5~1cm)、3年生白芍(断面直径多在1cm以上)3种规格的白芍用50%乙醇超声波处理后取上清液作为供试液,置高效薄层硅胶G板上展开,将层析显色后的斑点于GS-930薄层扫描仪上在可见区进行光谱扫描测定,结果1年生、2年生、3年生以上白芍芍药苷含量(%)(n=3)分别为1.04、2.21、3.57,1年生白芍芍药苷含量仅是3年生的不足1/3,提示在收获白芍时一定除去细小侧根及须根,从而提高生药质量。岳瑞等 [4] 以正丁醇-无水乙醇-冰醋酸-水(8:2:2:3)为展开剂,于λs=500nm,λR=670nm对购自不同药店的天花粉进行薄层扫描测定,结果瓜氨酸点样量在0.245~1.960μg范围内呈良好线性关系;平均回收率为99.4%,RSD为4.6%,且不同进货渠道的天花粉在瓜氨酸含量上有一定差异,认为该法可为天花粉药材及其制剂质量的进一步研究奠定基础。

    对于中成药,杨莉亚等 [5] 将巴布剂复方紫荆消伤膏中的紫荆皮、马钱子、独活、白芷按规定制成样品液,分别点于同一含CMC-Na的硅胶GF 254 薄层板上,按层析条件展开,并做对照试验、干扰性试验、稳定性试验等,用薄层色谱扫描法对方中士的宁含量进行测定,结果,在各供试品色谱中,均与对照品色谱中相应位置显相同颜色的斑点。笔者认为此法简便,重现性好,可有效地控制大复方产品的质量。

    3.2 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱 HPLC由于具有分离效能高、分析速度快等优点,近期已广为普及用于中药的定量分析,在中药的定性鉴别中亦能发挥很好的作用。李更生等 [6] 对不同产地地黄进行HPLC分析,将产于河南、陕西、山东、山西等的地黄制成供试品溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上,按薄层色谱条件进行扫描,结果表明河南产地黄中梓醇含量较高,山东嘉祥产地黄梓醇含量较低,说明河南产地黄作为道地药材有一定物质基础。游松等 [7] 以芦丁为内标物,运用HPLC法对银杏叶化学成分进行分析,从银杏叶药材、中间体及其注射剂中间体12批样品中得到20个共有峰,通过对各峰的相对保留时间和峰面积百分比比较,结果银杏叶药材、中间体及其注射剂的图谱有较好的相关性,12批样品非共有峰峰面积比均小于5%,有助于银杏叶药材的标准化种植及其制剂的质量控制。方晓明 [8] 采用高效液相色谱法测定复方天麻胶囊中天麻素的含量,选择D101型大孔吸附树脂柱对样品进行前处理,用甲醇-1%冰醋酸溶液(3:97)为流动相,对不同批号复方天麻胶囊进行天麻素含量测定,并计算回收率。结果,天麻素平均含量为5.81mg/g,RSD为1.67%;平均回收率为96.62%,RSD为1.20%,且稳定性好,可作为复方天麻胶囊主要质量控制指标。崔秀明等 [9] 采用HPLC法,对三七、人参、西洋参、姜状三七、三七不同部位以及2种三七混淆品温郁金、白及进行指纹图谱分析。在试验条件下,三七块根及根茎样品在10~19min均出现5个明显的共有特征峰,经与标准品对照,确定其中的4个共有特征按峰面积大小排列为:R  g1 >R  b1 >R  d >R 1 ;三七的地下部分与地上部分的HPLC指纹图谱也有明显差异,表现为根茎的峰面积>主根>大根,毛根的峰面积较小;实验结果显示三七、人参、西洋参和姜状三七的HPLC指纹图谱差异较大,温郁金和白及在相应位置上没有皂苷峰出现,可作为三七鉴别和质量控制的方法。曹现峰等 [10] 为了探索复方中药的主要有效部分群,试图建立一个可将黄连解毒汤中三大有效成分:生物碱类、黄酮类和环烯醚萜类的主要成分分开并表现出来的HPLC指纹图谱测定条件。采用二元或三元梯度供液,C 18 V反相色谱柱,对黄连解毒汤进行测定,结果各峰分离度较好,基线平稳,证明该法可将其三大有效部分的主要成分分离出来,表现出三大有效部分。

    3.3 气相色谱(GC)指纹图谱 GC具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少和分析速度快等优点。刘杰等 [11] 应用GC-8A气相色谱仪,对开胃消食口服液中乙酸龙脑酯进行气相色谱分析,结果乙酸龙脑酯及内标物萘都得到很好分离,可作为开胃消食口服液中乙酸龙脑酯及砂仁药材中乙酸龙脑酯的含量测定。杨光明等 [12] 采用气质联用分析技术对川芎不同溶剂提取物进行分析,并与同属植物当归比较,结果在色谱条件下,川芎以乙醚作为提取溶剂杂质较少。其提取物在14~22min(RT)之间均有一段峰群,保留时间分别位于17.95、18.40、18.84、19.52、19.63、19.87min附近,这一峰群保持着相似的峰高比例,而同属植物当归则与之不同,且在18.12min处当归比川芎多一个峰,在18.55、18.84min没有出峰,川芎的19.52、19.63min处的明显峰在当归图谱中也没有明显的特征性,可作为川芎的气相指纹图谱。刘桂霞等 [13] 运用GC-9A气相色谱仪,对冰硼含片中冰片的含量进行测定,结果冰片平均含量为0.847,回收率为99.90%,RSD=1.98%,认为该法可做为冰硼含片中冰片含量的定量方法,也为其它含冰片的中药制剂的冰片含量测定提供参考。

    3.4 高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱 HPCE技术在药材鉴定中的应用是近年发展起来的方法。侯连兵等 [14] 从三七及其混淆品菊叶三七的3种提取液(酸性、碱性、中性)所得到的图谱中,可以看出三七及其混淆品的HPCE图谱存在明显差异,克服了传统的以药材外观、显微、粉末、理化等鉴别方法专属性不强的缺点,可作为三七的鉴别方法。张朝晖等 [15] 对12种不同来源、不同产地海龙、海马类药材采用高效毛细管电泳法进行鉴别,结果种间区别明显,重现性好,对不同产地、不同贮存时间的同种药材进行分析,结果电泳图基本一致,为海龙、海马类药材的鉴别提供鉴别依据。赵新峰等 [16] 采用毛细管电泳法,在检测波长210nm,重力进样(10cm×5s),30mol/L硼砂溶液(pH=9.4)条件下对山药进行尿囊素含量测定,结果精密度良好,平均回收率为101.8%,RSD2.4%(n=5),可作为山药质量控制的一种方法。

    3.5 紫外光谱(UV)指纹图谱 由于不同中药所含成分的 不饱和程度有差异,因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异。陈伟君等 [17] 将紫外光谱用于蒺藜与混淆品软蒺藜的鉴别,效果良好。将蒺藜及软蒺藜用无水乙醇提取,以无水乙醇作空白,用紫外分光光度计扫描,结果蒺藜在204.6nm、233.4nm波长处有最大吸收,软蒺藜在203.8nm波长处有最大吸收,可达到鉴别目的。蒋伟哲等 [18] 为了考察广西各产地猫豆的品质,运用紫外分光光度法对采自宜州、东兰等地猫豆进行左旋多巴含量测定,结果猫豆种肉中左旋多巴以东兰产的含量最高,为9.35%,最低的产自田东,为6.99%;种皮中左旋多巴含量最高的产自田东,为0.43%,最低的为百色,为0.29%,提示石山地区猫豆品质最佳,更适合发展猫豆种植产业,这对于目前我国临床所用左旋多巴主要依靠进口,国内产品价格较高,有重要意义。刘桂明等 [19] 利用紫外及一阶导数对茵陈及其混伪品碱蒿、莳萝蒿、野艾等进行鉴别,结果发现,样品的零阶紫外光谱差异较小,而一阶导数光谱差异明显,可较好地区别。

    3.6 RAPD技术 现代分子生物学研究发现,中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源—“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果,RAPD技术可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性,为观察个体或群体的变异,为揭示“道地”药材的“地道”之本质提供线索。任冰如等 [20] 用RAPD法对苍术不同居群间的亲缘关系进行分析。选取10种10碱基随机引物,对苍术10个居群的83个个体进行扩增,共获得100个DNA片段,其中65个片段为多态的(占65%),根据扩增结果进行统计分析,结果表明苍术10个居群可划分为大别山、南苍术、北苍术3个类群,并且南、北苍术类群之间遗传距离较近,而大别山类群与前2者的遗传距离较远。陈林姣等 [21] 采用RAPD技术对中药溪黄草类4种原植物进行研究。将每个品种各取10株植物的幼嫩叶片,混合提取总DNA进行实验,对76个10mer-寡核苷酸引物进行PCR扩增,共筛选出14个扩增产物重复性好的引物,14个有效引物共检出194个位点,其中品种特有位点108个,占56.6%。品种特有位点可作为区别不同种的遗传标记。实验表明,溪黄草扩增出的6条带,其它种均与之不同;线纹香茶菜在1167bp,638bp处各有一条特异性带;细花线纹香茶菜较狭基线纹香茶菜多一条920bp带而相区别;不同产地的狭基线纹香茶菜的扩增产物完全一致,取得较好鉴定结果。梁之桃等 [22] 利用CTAB法提取柴胡属5种植物总DNA,以OPD-1、OPD-8、OPD-113个随机引物进行非特异扩增,结果,3个有效引物共扩增54个DNA片段,其中公共片段3个,多态性片段51个,占94.4%。通过对RAPD扩增片段进行统计分析,建立种系发生图。图中显示,种内遗传变异比种间遗传变异小,可作为柴胡属植物鉴定和分类的依据。黄芸等 [23] 则利用RAPD技术,以随机引物进行随机扩增,对射干类药材及其混淆品鸢尾属植物鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等5种药用植物进行分子水平鉴定,结果表明,用OPD-8可以将射干鸢尾、野鸢尾、德国鸢尾、蝴蝶花等4种鸢尾属植物完全区分开,且任意两个样本间的遗传距离指数表明射干与野鸢尾间的亲缘关系较近,野鸢尾与鸢尾的亲缘关系较远。

    3.7  1 HNMR指纹法  1 HNMR指纹法是一种新的植物中药鉴定方法,有单一性、全面性、定量性和易辨性4个特点。赵天增等 [24] 通过对25类不同科属36种植物中药的152个不同来源样品及部分中药伪品的考察,证实同种植物中药特征总提取物A和B的 1 HNMR指纹图有很好的重复性和高度的特征性,可以用来鉴别植物中药的品种;根据 1 HNMR指纹图谱,可对同科不同属植物进行属间和种间的区分。赵等还认为要使植物中药的 1 HNMR指纹图谱便于使用、推广和普及,更加科学化,必须对其进行规范化,如建立60MHz和超导两种磁场条件下的 1 HNMR指纹图;选择一个分辨率最好的、最具有代表性的、最佳的图谱作为相对标准 1 HNMR指纹图进行绘制,并标出具代表意义的共振峰,多个共振峰在一起分辨不清楚时,图谱要拉宽;在相对标准 1 HNMR指纹图下面要有 1 HNMR数据表,列出所有具有代表意义的共振峰数据;为了便于辨认 1 HNMR指纹图,已鉴定的化学成分结构式及其名称均要标出。

  4 中药指纹图谱的局限性

  (1)由于中药成分复杂,已知的化学成分不能完全代表该药的全部疗效,用这些成分作为参比标准,其与药理作用之间的相关性不明确,人们无法从指纹图谱中解析某一峰或某一段峰所代表的药理作用,而使用色谱分析法获得的指纹图谱常常将未达到基线分离的色谱峰作为特征峰分峰,因此无法检验这些峰的纯度,也不能确定某一组分对该峰的贡献,也就是说样品的指纹图谱与标准指纹图谱相符有时并不能表示样品与标准相符。

    (2)中药样本的取样受中药所属科种属、产地、采收季节、贮存条件、道地药材与非道地药材的差异、炮制品、掺伪现象等因素影响,给指纹图谱分析带来一定困难。

    (3)对色谱图的判定,仍需人工处理数据与图谱,往往由于人为的主观误差,很可能会作出不同的判断。

    (4)制备指纹图谱必须设立参照物,如果该中药化学成分不明确时则无法建立能确认该中药的指纹图谱。

    因此建立在化学成分模糊不清基础上的中药指纹图谱质量控制方法只能是一种过渡性质量控制方法,其本身有许多需要完善的地方,但它在区分中药材方面,甚至是不同产地的药材鉴定方面有着显著的优点,这对目前中药材的鉴定和分类很大程度还依赖于经验和表观分析,意义重大。通过指纹图谱分析既可以避免有毒植物误用,又有利于发现新种。而要建立不同品种中药材的标准指纹图谱库是一项大量而细致的工作,需要国家政策调整,企业和科研单位协作攻关,因此,广大中药工作人员任重而道远。
 
  【参考文献】

    1 冯雪松,董鸿晔.中药指纹图谱中的数据挖掘技术.药学进展,2002,26(4):198.

    2 乔春峰,徐珞珊,董辉,等.闭鞘姜类药材的鉴别研究.中草药, 2002,33(1):38-39.

    3 张雪荣.薄层扫描法测定不同生长年限白芍中芍药苷的含量. 中成药,2000,31(11):832.

    4 岳歧林,傅强.双波长薄层扫描法测定天花粉中瓜氨酸的含量. 西北药学杂志,2002,17(3):107.

    5 杨莉娅,谢松,吴云鸣.巴布剂复方紫荆消伤膏质量标准研究. 中草药,2000,31(11):826.

    6 李更生,刘长河,王慧森,等.不同产地的地黄中梓醇含量比较.中草药,2002,33(2):126-128.

    7 游松,王亮,蒋稚红,等.银杏叶注射剂指纹图谱的研究.中草药,2002,33(3):216-218.

    8 方晓明.HPLC法测定复方天麻胶囊中天麻素的含量.现代中药研究与实践,2003,17(4):50.

    9 崔秀明,董婷霞,陈中坚,等.三七及其混淆品的HPLC指纹图谱 鉴定.中草药,2002,33(10):941.
    10 曹现峰,沈嘉.黄连解毒汤的HPLC指纹图谱测定条件初探.中成药,2003,25(7):519.

    11 刘杰,邱保国,都恒青,等.气相色谱法测定开胃消食口服液中乙酸龙脑酯的含量.中成药,2002,24(1):23-25.

    12 杨光明,蔡宝昌,王天山,等.川芎化学成分的气相质谱与指纹图谱研究(Ⅰ).西北药学杂志,2002,17(4):147.

    13 刘桂霞,杨胜亚,蔡中琴.气相色谱法测定冰硼含片中冰片的含量.中草药,2000,31(9):674.

    14 侯连兵,陈振德,陈志良,等.三七及其混淆品蛋白多肽高效毛细管电泳法鉴别.中草药.2000,31(11):859.

    15 张朝晖,范国荣,徐国均,等.12种海龙、海马类药材高效毛细管电泳法鉴别.中国中药杂志,1998,23(5):259.

    16 赵新峰,孙毓庆.毛细管电泳法测定山药中尿囊素的含量.中草药,2002,33(11):1038.

    17 陈伟君,李晓燕.蒺藜与混淆品软蒺藜的鉴别.中草药,2002,33(4):365.

    18 蒋伟哲,周燕文,吴闯,等.不同产地猫豆中左旋多巴的含量比较.中草药,2000,31(11):860.
    19 刘桂明,宋平顺.茵陈及混伪品的紫外光谱.中草药,2000,31 (8):631.

    20 任冰如,贺善安,於虹.用RAPD技术评估苍术居群间的亲缘关系.中草药,2000,31(6):458.

    21 陈林姣,屈良鹄,施苏华,等.RAPD技术在溪黄草类原植物鉴别中的应用.中国中药杂志,1998,23(6):328-330.

    22 梁之桃,秦民坚,王峥涛,等.柴胡属5种植物RAPD分析与分类鉴定.中草药,2002,33(12):1117.

    23 黄芸,秦民坚,杨光,等.RAPD法鉴定射干类中药.中草药,2002,33(10):935.

    24 赵天增,秦海林,梁晓天. 1 HNMR图谱指纹法鉴定植物中药.中草药,2000,(31)11:868.

     作者单位:530031广西南宁,广西医科大学第三附属医院

  (编辑:黄 杰)


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