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RNA干扰作用原理及其应用

来源:INTERNET 作者:林燕燕 陈爱萍 刘 超 2005-7-8
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摘要: 【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式,是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siR-NA介导的特异性高效抑制基因表达途径,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征,反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。...


  【摘要】  RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式,是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siR-NA介导的特异性高效抑制基因表达途径,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征,反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。

    【Abstract】 RNA interference(RNAi)in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient origin.RNAi is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-strand-ed RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanismwill help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug.

    【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced si-lencing complex(RISC) Argonaute pol III

    1 背景

    20多年前,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个发现:Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制,Jor-gensen将这种现象命名为协同抑制(cosuppression)。在真菌中也有类似的现象,1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这种现象。当时将这种现象命名为基因表答的阻抑作用(quelling) [1] 。通过对转基因植物的研究,发现相应基因的转录并不受影响,将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)。转录后的基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子和RNA病毒的防御机制,可能在植物和动物分化之前就已经出现。1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将双链dsRNA(double-stranded RNA)注入线虫,结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默。将这种由dsRNA(double-stranded RNA)引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用(RNA interference RNAi) [2] 。

    2 RNAi的分子机制

    dsRNA(double-stranded RNA)可以介导基因沉默作用,以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子。哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA),其一是特异性路径:特殊dsRNA的序列用于RNAi,起始阶段dsRNA被切成siRNA(small interfering RNA或short interfering RNAs)。siR-NA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子,能提供一定的信息,允许一个特定的mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基,其中19个碱基配对,再每条链的3'端都有2个不配对的碱基(图1)。

    图1 siRNA

    另一条是非特异性路径:只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA,抑制所有蛋白质的合成。长的dsR-NA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子,导致翻译抑制。也可以通过激活2'-5'AS合成一个分子激活RNase L,导致非特异的RNA降解 [3] 。关于特异性的RNA作用机制模型,包括起始阶段和效应阶段 [4] 。起始阶段dsRNA在Dicer酶(RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,属内切核酸酶)的作用下加工裂解21-23核甘酸长的小分子干扰RNA片断(siRNA) [5] 。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。在RNAi的效应阶段,siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物(RNA-induced silencing complex or RISC),在siRNA解双链即RISC激活过程需一个ATP [5] 。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合,随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成,包括核酸酶,解旋酶和同源RNA链搜索活性等。最新研究表明,Argonaute蛋白为RISC的特有成分,被比喻成“切薄片的机器”。onaute有一个月牙型的底座由三部分组成,分别为N-端(amino-terminal)、中部(middle)和PIWI区域(PIWI domain)。在月牙底座上面有一个PAZ部分,由茎杆结构支撑。Argonature蛋白有一个明显的凹槽贯穿整个蛋白,凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合。siRNA解旋后,siRNA单链的3'端伸入PAZ的裂缝中,整个单链沿着PAZ伸展开,同时目的片段mRNA结合于新月型底座。mRNA与siRNA互相配对形成双链后,在离单链siRNA5'端9个碱基处(即离siRNA3'端11-12个碱基处)切割mRNA(图2) [6] 。

    图2 siRNA引导mRNA被切割的模型3 siRNA的表达

    最便利的siRNA表达载体用三种RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种(Sui2002,Lee2002,Paul2002),操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达(图3) [7] 。

    图3 hairpin siRNA

    这类启动子有大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子 [8] 。采用RNA pol III启动子是因为它结构简单,而且可在哺乳动物细胞中表达小分子RNA,并且它可通过一串(3-6个)U来终止转录的,这刚好符合原始设计的siRNA的3'端含有2个突出碱基U(Elbashir2002)。使用这类载体,首先要设计2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,然后订购这2段DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III启动子下游。克隆可能要几周甚至数月的时间,为保证克隆的序列的正确性,还要进行测序。   病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞并维持较长时间的基因沉默 [9] 。siRNA目标位点的筛选是实现RNAi作用的关键,一般有以下几个原则 [10,11] :(1)在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列,起始是AA;(2)找2~4个小片段的RNA,通过SECs(siRNA expression cassettes,SECs)筛选最有效的siRNA;(3)在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域;(4)通过BLAST确定片断的特异性;(5)片断GC%应该在30%~50%。

    4 RNAi的应用前景

    4.1 研究信号传导通路和基因功能 RNAi能够在哺乳动物中降低特异性基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间,控制基因表达的部位。

    4.2 开展基因治疗的新途径 一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因表达同时降低的表现,也可同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。为治疗多基因调控的肿瘤疾病,带来新的治疗策略。

    参考文献

    1 Isolation of quelling-defective(qde)mutants impaired in posttran-scriptional transgene-induced gene silencing in Neurospora crassaProc.Natl Acad Sci USA,1997,94:10233-10238.

    2 Fire A,Xu S,MontgomeryMK,et al.Potent and specific genetic inter-ferenceby double-strand RNA in coenorhabditis elegans.Nature,1998,391(6669):744-745.

    3 Nature,2001,411,428-429.

    4 Matzke.M,Matzke A J,Kooter JM.RNA:guiding gene silencing.Sci-ence,2001,293(5532):1080-1083.

    5 Nykanen A,Haley B,Zamore P D.ATP requirements and small interfer-ing RNA structure in the RNA interference pathway.Cell,2001,107(3):309-3021.

    6 Ji-Joon Song,Stephanie K.Smith Gregory J.Hannon,1Leemor Joshua-Tor1,2*3Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity SCIENCE,2004,305.

    7 Yu J.-Y.,DeRuiter S.L.,Turner,D.L.RNA interference by ex-pression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(9):6047-6052.

    8 Miyagishi M,Taira K.U6promoter-driven siRNAs with four uridine3'overhangs effectively suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnology,2002,20:497-500.

    9 Gustavo Tiscornia,Oded Singer,Masahito Ikawa,et al.A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressing small interfering RNA Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(4):1844-1848.

    10 Brown D,Jarvis R,Pallotta V,et al.RNA interference in mammalian cell culture:design,execution,and analysis of the siRNA effect.Ambion TechNotes9(1):3-5.

    11 Sui G,Soohoo C,Affar EB,et al.A DNA vector-based RNAi tech-nology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci.US A,2002,99(8):5515-5520.

     作者单位:350007福建师范大学生物工程学院发育生物学研究室


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