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注射用头孢替唑的细菌内毒素检查

来源:INTERNET 作者:赵广富 2005-7-7
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摘要: 【摘要】 目的 建立注射用头孢替唑的细菌内毒素检查法。 方法 根据《中国药典》2000年版二部收载的细菌内毒素检查法的要求进行实验。67mg/ml的样品溶液对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰。67mg/ml可用灵敏度为0。...


  【摘要】 目的  建立注射用头孢替唑的细菌内毒素检查法。 方法  根据《中国药典》2000年版二部收载的细菌内毒素检查法的要求进行实验。 结果  1.67mg/ml的样品溶液对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰。 结论  将注射用头孢替唑稀释至1.67mg/ml可用灵敏度为0.125Eu/ml的鲎试剂作细菌内毒素检查,其取代热原检查法是可行的。
    
      
  根据鲎试剂在没有干扰物质存在下能与细菌内毒素起凝集反应的机制,笔者对第四代头孢菌素类药物头孢替唑做细菌内毒素检测试验,以探讨用细菌内毒素检查法取代热原检查法的可行性。

  1 仪器与材料
    
  1.1 仪器 净化工作台(苏州市姑苏空调净化有限公司);恒温水浴箱(上海医疗器械三厂);微量取液器(上海医用激光仪器厂);旋涡混合器(海南麒麟医用仪器厂)。

     1.2 材料 鲎试剂(厦门鲎试剂厂,λ=0.25Eu/ml,规格0.1ml/支,批号031008;λ=0.125Eu/ml,规格0.1ml/支,批号031112;湛江安度斯生物有限公司,λ=0.125Eu/ml,规格0.1ml/支,批号030915);细菌内毒素工作标准品(湛江安度斯生物有限公司,规格10Eu/支,批号030826);细菌内毒素检查用水(厦门鲎试剂厂,规格2ml/支,批号031102);注射用头孢替唑(天津新丰制药有限公司,规格1.0g/支,批号030518,030722,031025)。

  2 方法与结果
    
  2.1 细菌内毒素限值(L)的确定 按“细菌内毒素检查法应用指导原则” [1] 的规定,用公式L=K/M计算注射用头孢替唑的L值。本品人用每次最大剂量为4g,人体平均体重按60kg计算,人用每公斤体重每小时最大剂量M=4000/60=67mg/(kg·h),细菌内毒素致热阈K=5Eu/(kg·h),本品细菌内毒素限值L=K/M=5/67=0.075Eu/mg。

     2.2 本品最大有效稀释倍数(MVD)及其浓度(C  MVD ) 注射用头孢替唑1次最大剂量为4g,按溶解在250ml溶液中计算,其浓度为16mg/ml,选用灵敏度为0.25Eu/ml鲎试剂时,MVD=CL/λ=16×0.075/0.25=4.8倍,CMVD=16/4.8=3.33mg/ml;选用灵敏度为0.125Eu/ml鲎试剂时,MVD=16×0.075/0.125=9.6倍,CMVD=16/9.6=1.67mg/ml。

  2.3 鲎试剂灵敏度(λ)复核试验 根据鲎试剂灵敏度标示值(λ 1 =0.25Eu/ml,λ 2 =0.125Eu/ml),将细菌内毒素工作标准品用检查用水溶解,置旋涡混合器上混合15min,然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30s。取上述每一浓度0.1ml,分别加至待复核的0.1ml鲎试剂中,每一浓度平行做4管,同时用检查用水做2管阴性对照,置37℃恒温水浴中保温60min,结果0.5λ b <λ c <2λ b ,此两种灵敏度的鲎试剂均符合规定。
   
  2.4 干扰试验 根据样品溶液的最大有效稀释倍数,先选用1:4.8的样品稀释液(3.33mg/ml)将同一支细菌内毒素工作标准品稀释成0.5,0.25,0.125,0.062Eu/ml溶液(Et),取每一浓度0.1ml,分别加至λ=0.25Eu/ml的0.1ml鲎试剂中,每一浓度平行做4管,在37℃恒温水液中保温60min,同时用检查用水将细菌内毒素工作标准品同上法稀释(Es)与鲎试剂反应,结果见表1。
   
  结果表明,样品在3.33mg/ml浓度时,Et>2.0Es,对鲎试剂有明显的抑制作用。为此,根据MVD的计算值,将样品溶液稀释成1:9.6的浓度(1.67mg/ml),改用λ=0.125Eu/ml的鲎试剂,同上法进行干扰试验,结果见表2。
   
  根据公式Es=lg -1 (∑Xs/4)和Et=lg -1 (∑Xt/4)计算得Es=0.125,Et1=0.149,Et 2 =Et 3 =0.125,Es∈[0.5λ,2.0λ],3个样品的Et∈[0.5Es,2.0Es]。以上结果表明,样品在该浓度下不干扰试验,该浓度可确定为无干扰浓度。同法用另一厂家生产的鲎试剂做干扰试验结果一致。

  表1 样品稀释液(3.33mg/ml)干扰试验结果略

     表2 样品稀释液(1.67mg/ml)干扰试验结果略

     2.5 样品细菌内毒素检测 将3批热原检查合格的注射用头孢替唑分别用检查用水稀释成1.67mg/ml的浓度,使用灵敏度为0.125Eu/ml的鲎试剂做细菌内毒素检查,同时做阴性对照,阳性对照和样品阳性对照,按照《中国药典》2000年版二部附录XIE [1] 操作,结果样品管和阴性管均为阴性,阳性管和样品阳性管均为阳性;样品未检出细菌内毒素。

  3 讨论
    
  细菌内毒素检查法,作为一种取代传统热原检查法(家兔法)用于检查药品热原的方法,以其简便、灵敏、快速、准确等优点受到世界各国的普遍重视及广泛应用。我国从1995年版药典开始收载至2000年版药典已有数十种液体注射剂使用鲎试剂检查细菌内毒素,而固体配方注射剂则显示出对细菌内毒素试验的抑制,尤其是抗生素,在药用浓度下可抑制鲎试剂形成凝胶。根据“干扰的程度与供试品的浓度呈正相关” [2] 的道理,本试验采用最大有效稀释法分析并解决了注射用头孢替唑对鲎试剂的干扰作用,经干扰试验确证,样品稀释至1.67mg/ml,选用灵敏度为0.125Eu/ml的鲎试剂可检测样品的细菌内毒素。
    
  参考文献
    
  1 国家药典委员会.中国药典(二部),北京:化学工业出版社,2000,附录204,86.

    2 黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查实验设计.中国药学杂志,1997,32(2):72.    

  作者单位:222023江苏省连云港市第二人民医院


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