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培养法与荧光定量聚合酶链反应法检测生殖道解脲支原体的方法学比较

来源:INTERNET 作者:卢解红 唐跃华 梁世弦等 2005-7-6
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摘要: 【摘要】 目的 比较液体培养法和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法2种常用检测解脲支原体(Uu)的方法,并分析其优缺点。方法 应用培养法与FQ-PCR法对85例不孕不育妇女的宫颈拭子标本进行解脲支原体检测。结果 种检测方法符合率为82。结论 培养法和PCR法都可作为检测Uu的有效方法,临床可根据实际需要选择采用。...


  【摘要】 目的 比较液体培养法和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法2种常用检测解脲支原体(Uu)的方法,并分析其优缺点。方法 应用培养法与FQ-PCR法对85例不孕不育妇女的宫颈拭子标本进行解脲支原体检测。结果 种检测方法符合率为82.35‰。差异无显著性(P>0.05)。结论 培养法和PCR法都可作为检测Uu的有效方法,临床可根据实际需要选择采用。

  支原体是一群介于细菌与病毒之间的原核生物,是引起非淋菌性泌尿生殖道炎症的重要病原体,而解脲支原体(Uu)是主要的病原体之一。国内外学者曾报道Uu感染可导致女性不孕不育 [1]  。我们应用液体培养法与荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法同时检测不孕不育妇女的宫颈拭子的Uu,比较他们的结果及2种检测方法的优缺点。

  1 资料与方法

  1.1 研究对象 来我院辅助生育中心就诊的不孕不育妇女85例。

  1.2 试剂和仪器 支原体培养试剂由珠海浪峰生物有限公司生产;而FQ-PCR试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心生产。仪器:培养箱,加样器,PE7700看动荧光PCR仪(ABI Prism7700Sequence Detector美国Perkin Elmer公司产品)。

  1.3 标本采集方法 用无菌棉拭子插入宫颈1~1.5cm取分泌物标本2份;1份放入支原本培养的液体培养基中,而另1份放入生理盐水中做PCR检测Uu。

  1.4 实验方法

  1.4.1 支原体液体培养法 在第一排的第一孔加入100μl不含标本的液体培养基作为阴性对照,而其他孔则加入100μl含标本的培养液,再加2滴石蜡油,盖上盖子放入温箱中培养24~48h,24h观察Uu结果,48h观察Mh结果。反应孔(Uu≥10 4 或Mh≥10 4 )呈桔黄色或红色为阳性。
  1.4.2 FQ-PCR法 将标本洗涤液12000rpm离心5min,弃去上清液,采用常规碱裂解法提取Uu-DNA,加样后将各反应管放入PE7700自动荧光检测仪,按下列条件扩增:93℃2min预变性,然后按93℃45s或55℃120s共做40个循环,反应结束后,由电脑自动分析计算出定量结果。每批FQ-PCR-Uu试剂盒均做定量阳性标准曲线,每次检测均做阳性和阴性对照。

  2 结果

  对85例宫颈拭子中Uu的检出结果,培养法阳性58例,阳性率为68.24‰;FQ-PCR法阳性55例,阳性率为64.71‰。用SPSS统计分析软件进行分析,用配对计数资料的χ 2 检验结果表明:P=0.754,差异无显著性(P>0.05),也就是说培养法与FQ-PCR法在检测生殖道Uu时,结果差异无显著性,结果见表1。2种方法的检测结果不完全相同,如培养法阳性的58例中有49例FQ-PCR结果为阳性,9例为阴性。Uu培养阴性的27例中有6例FQ-PCR结果为阳性。符合率为82.35‰。表1 2种方法检测Uu的结果 (略)

  3 讨论

  实验结果表明2种检测方法其阳性率差异无显著性。两种方法者可以满足临床的需要。2种方法之间各有其优缺点。液体培养法是根据Uu含有脲酶 [2]  ,可分解培养基中的尿素,使pH升高,致使酚红指示剂由淡黄色变为桃红色或紫红色。它具有操作简单,不需要特殊的仪器或设备,可同时检测Uu和Mh2种支原体,而且可同时做药敏试验,给临床提供用药参考依据,适用于基层医院开展支原体的检测。但由于女性生殖道内杂菌较多 3],当标本中杂菌的量超过培养基中加入的抗生素的抑菌能力时,可导致培养基pH值改变,使指示剂显色出现假阳性结果。FQ-PCR技术是国内外近年发展起来的新的核酸检测技术 [4,5]  ,它在常规PCR基础上,加入了一条荧光基因标记的特殊探针。荧光信号强度伴随着PCR产物的增长而增长,根据这原理,在PCR过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化,待反应结束后,自动计算出起始DNA的拷贝数。该技术从根本上解决了常规PCR不能定量的问题,可以做多种技原体的检测,具有快速、特异性、灵敏度高等特点。但它需要特殊的仪器与设备,且仪器价格昂贵,实验室的条件要达到较高标准,一旦控制不好也会有假阳性或假阴性疗效的依据。总之,2种方法都是检测Uu的有效方法,各有利弊,使用时应根据具体实际情况加以选择。

  参考文献

  1 任平,章晓梅,朱瑛,等.孕早期CT、Uu感染对流产的临床细胞诊治研究.中国优生与遗传杂志,1999,7(4):69.

  2 StylerM,Shapiro SS.Mouicutes(mycoplasma)infertility.Fettil steril,1985,44:1.   

  3 鄂征.组织培养技术,北京:人民卫生出版社,1982,188.

  4 Gibson EM,Heid CA,Williams PM.A noved method for real time quanˉtiative RT-PCR.Genome Res,1996,6:995-1001.

  5 Heid CA,Steuens J,Livak KJ,et al.Real time quantitative PCR.Genoml Res,1996,6:986-994.   

  6 刘颖,邹先进,蔡兰,等.荧光定量聚合酶链反应检测解脲支原 体感染的临床意义.中国优生与遗传杂志,2003,11(4):23-24.

  作者单位:528300广东省佛山市顺德人民医院检验科


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