HPLC法测定山茱萸中熊果酸的含量

【摘要】目的建立山茱萸中熊果酸的含量测定方法。结论该方法简便、重复性好，可作为山茱萸质量控制方法。中国药典2000年版一部山茱萸是用薄层扫描法测定熊果酸含量，由于薄层扫描法测定误差大，近年来已有不少用HPLC法测定熊果酸的含量的文献报导。本文拟用HPLC法对山茱萸中熊果酸进行了定量分析，现将结果报告如下。...

　　【摘要】目的建立山茱萸中熊果酸的含量测定方法。方法采用HypersilODS色谱柱;流动相为乙腈-甲醇-水-醋酸铵（68∶10∶22∶0.5）;检测波长为220nm;流速为1ml/min。结果在1.99～9.96μg范围内具有良好的线性关系，r=0.9994，平均回收率为97.63%，RSD=1.00%。结论该方法简便、重复性好，可作为山茱萸质量控制方法。

　　中国药典2000年版一部山茱萸是用薄层扫描法测定熊果酸含量，由于薄层扫描法测定误差大，近年来已有不少用HPLC法测定熊果酸的含量的文献报导。本文拟用HPLC法对山茱萸中熊果酸进行了定量分析，现将结果报告如下。

　　1 仪器与试药

　　HP-1050高效液相色谱仪;乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯;熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号742-200111）;山茱萸（购于广东省药材公司中药饮片厂）。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件色谱柱:Hypersil ODS（250×4.0mm，5μm）;流动相为乙腈-甲醇-水-醋酸铵（68∶10∶22∶0.5）;流速:1ml/min;检测波长:220nm;柱温:室温，在上述条件下样品中熊果酸（保留时间为18.9min）与齐墩果酸（保留时间为17.8min）等成分分离度大于1.5，理论塔板数大于8000，见图1～2。图1 熊果酸对照品HPLC图谱图2 山茱萸HPLC图谱

　　2.2 对照品溶液的制备取熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得。

　　2.3 供试品溶液的制备取本品粗粉约1g，精密称定，置索氏提取器内，加乙醇醚适量，加热回流提取4h，提取液回收乙醚至干，残渣加石油醚（30℃～60℃）浸泡2次，每次15ml（约浸泡2min），倾去石油醚，残渣加甲醇微热使溶解，定量转移至5ml量瓶内，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

　　2.4 线性关系考察精密称取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.498mg的对照品溶液。分别精密吸取熊果酸对照品溶液4、8、12、16、20μl，按上述色谱条件进样测定，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为Y=109.004X+11.996，r=0.9994，在1.99～9.96μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验精密吸取上述对照品溶液（0.498mg/ml）10μl，重复进样5次，平均峰面积为565.691，RSD为1.80%。

2.6 稳定性试验对同一熊果酸对照品溶液，每隔2h测定1次，结果平均峰面积为567.013，RSD为2.11%，在8h内较稳定。

2.7 重复性试验取同批样品5份，按含量测定项下方法平行试验，测得样品中熊果酸的含量平均为0.21%，RSD=2.65%。

2.8 加样回收率试验精密称取已知含量的样品适量，精密加入一定量的熊果酸对照品溶液（0.5mg/ml），按供试品溶液的制备及样品测定项下操作，结果见表1。表1 加样回收率试验结果样品含量

　　2.9 样品测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪中，测定峰面积，按外标法计算含量，结果三批山茱萸药材含量分别为0.20%、0.21%、0.24%，RSD分别为3.85%、0.64%及2.76%。

　　3 讨论

　　文献报导熊果酸的甲醇液在206nm ［1］、205nm ［2］处有最大吸收，在此波长下测定含量溶剂干扰很大。有文献［3］采用蒸发光散射检测器测定熊果酸的含量，以减少试剂的影响。由于蒸发光散射检测器还未能普及，多数文献仍采用紫外检测器进行熊果酸的含量测定。为了减少流动相引起的基线噪音，文献多用210nm ［4］、215nm ［1，2］、220nm ［5］为检测波长，通过多次试验发现，在210nm、215nm仍有较大的基线噪音，220nm基线噪音较小，最后确定检测波长为220nm。中药中齐墩果酸和熊果酸常并存，由于两者性质相似，不易将两者分离，因此流动相的选择应考虑使两成分能达到基线分离。文献报导能使齐墩果酸和熊果酸达到基线分离的流动相有乙腈-甲醇-水-醋酸铵（70∶16∶14∶0.5） 1］，乙腈-甲醇-水-醋酸铵（60∶14∶28∶0.6）［2］甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（87∶13∶0.04∶0.02）［4］，甲醇-水（88∶12）［5］，经试验通过调节乙腈-甲醇-水适当比例，加入醋酸胺作为改性剂，可使齐墩果酸和熊果酸基本达到基线分离，试验最后确定乙腈-甲醇-水-醋酸铵（68∶10∶22∶ 0.5）作为流动相。供试品溶液的制备方法是参考中国药典2000年版一部山茱萸的制备，通过试验，用HPLC法替代薄层扫描法测定3批山茱萸含量，均在中国药典规定的范围内，表明本方法可行。