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皂甙提取物宫血宁止血作用机制的研究

来源:INTERNET 作者:赵振虎 善亚君 柳晓兰 苑晓玲 刘红岩 唐书明 冯 有 从玉 2005-6-29
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摘要: 【摘要】 目的 探讨宫血宁口服给药后机体止血作用机制。方法 凝血酶检测(APTT,PT,TT)、血小板生成及血小板聚集功能实验。结果 给予宫血宁治疗后,APTT、PT和TT没有明显改变,血小板数量增加,聚集功能增强。结论 宫血宁不影响凝血因子的生成或功能,宫血宁对血小板数量和聚集功能的影响是其发挥止血作用的基础。...


  【摘要】 目的 探讨宫血宁口服给药后机体止血作用机制。方法 凝血酶检测(APTT,PT,TT)、血小板生成及血小板聚集功能实验。结果 给予宫血宁治疗后,APTT、PT和TT没有明显改变,血小板数量增加,聚集功能增强。结论 宫血宁不影响凝血因子的生成或功能,宫血宁对血小板数量和聚集功能的影响是其发挥止血作用的基础。

Research about the hemostatic mechanism of saponin extract

Gongxuening Zhao Zhenhu,Shan Yajun,Liu Xiaolan,et al.

Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Sciences,Beijing100850.

【Abstract】 Objective To investigate the hemostatic mechanism of Gongxuening after oral administration.Methods The activity of thrombin was evaluated with Activated Partial Thromboplastin Time(APTT),Prothrombin Time(PT)and thrombin time(TT).Thrombopoiesis and platelet aggregation was also analyzed.ResultsAPTT,PT and TT didn’t change obviously after animals were orally administrated with Gongxuening,while the number and the aggregation ability of platelets both increased significantly.Conclusion Gougxuening doesn’t affect the generationand function of coagulation factors,and its hemostatic effect is executed by increasing the number and the aggregation ability of platelets.

Key words gongxuening thrombin thrombopoiesis aggregation

宫血宁是从植物中提取的总皂甙,主要用于治疗妇科疾病,具有缩宫止血、消炎镇痛等功效,尤其对子宫功能性出血、大小产后出血、月经过多等症有显著疗效 [1~3] 。近年来有关皂甙类化合物可抑制血小板聚集文献报道较多,皂甙类化合物促血小板聚集的资料研究甚少 [4] ,为了阐明皂甙类提取物宫血宁对子宫止血作用机制,我们以大鼠、小鼠为对象,研究了宫血宁口服给药后对动物部分凝血酶激活时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血时间(TT)、血小板生成及血小板聚集功能的影响,为阐明宫血宁止血作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wister大鼠,雌性,体重180~220g,Balb/c小鼠,雌性,体重18~22g。由军事医学科学院实验动物中心提供,医动字D01-3039。

1.2 试剂 APTT、PT、TT试剂盒(购于上海太阳生物技术公司);ADP(Sigma公司);宫血宁胶囊由云南白药制药股份有限公司提供(批号20000508),已烯雌酚(Diethylstibestrol北京益民制药厂,批号9900402)。

1.3 仪器 LUMI AGGRO-METTR型血小板聚集仪(美国):TYXN-96B智能凝血测定仪(上海),GF-820血细胞计数仪(日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 部分凝血酶激活时间(APTT)的原理 激活部分凝血酶时间(APTT)是测定内源凝血系统较为敏感的筛选试验。在37℃下,以白陶土(激活剂)激活因子Ⅻ和Ⅺ,以脑磷脂(部分凝血活酶)代替血小板提供凝血的催化表面,在因子Ⅳ的参与下,观察贫血小板血浆凝固所需时间。参照试剂盒说明书操作。

1.4.2 凝血酶原时间(PT) 是外源凝血系统常用筛选方法之一。在受检血浆中加入过量的因子Ⅲ(兔脑、人脑等浸出液)和Ca 2+ 使因子Ⅱ转变为凝血酶,后者使因子Ⅰ转变为纤维蛋白,观察血浆凝固所需时间。参照试剂盒说明书操作。

1.4.3 凝血酶时间(TT) 外源凝血因子加入标准化的凝血酶后,血浆凝固的时间。参照试剂盒说明书操作。

1.4.4 外周血细胞计数Balb/C小鼠40只,18~22g雌性。按体重分成4组,分别为正常对照、宫血宁75mg/kg、宫血宁150mg/kg、宫血宁300mg/kg,每日分2次口服给药,共9次。于给药前、给药后1天、3天、5天、7天、10天、14天尾静脉取血20μl,F-820血细胞计数仪检测血象。

1.4.5 血小板聚集试验 [5] 动物分组:Wistar大鼠16只,分为4组,分别为正常组、75mg/kg组、150mg/kg组和300mg/kg组,每日给药2次,共7次,末次给药后1h麻醉取血。血小板分离:参照血小板分离方法 [5] ,Wistar大鼠,戊巴比妥腹腔(40mg/kg)麻醉,心脏取血,3.8%柠檬酸钠(体积比1:9)抗凝。于室温800rpm离心10min,取上层含富血小板血浆(PRP)。室温3000rpm离心20min,取上层贫血小板血浆(PPP)。血小板计数:用F-820血细胞计数仪计数,用贫血小板血浆(PPP)调整血小板数为3×10 8 /ml。图形测量:Chronolog血小板聚集仪检测。样品于37℃保温2min,放入检测器。PRP体积450μl,再加50ul ADP(终浓度2×10 -4 mol/L)诱导聚集。然后记录5min图形,读取1min、2min、3min、5min及最大的聚集率。

1.5 统计学处理 实验数据以X±s表示,并分别进行t检验分析评价。

2 结果

2.1 宫血宁口服给药对大鼠出凝血指标的影响 激活部分凝血酶时间(APTT)是测定内源凝血系统较为敏感的筛选试验,血浆凝血酶原时间(PT)是外源凝血系统常用筛选 方法之一,凝血酶时间(TT)是检测血浆纤维蛋白原含量变化的一种简便方法。表1比较子宫血宁口服给药后大鼠APTT、PT和TT的变化,结果显示,同对照组相比,各实验组APTT、PT和TT没有明显缩短,说明宫血宁对机体内源性和外源性凝血机制影响不显著,其本身也不具有凝血因子的作用。见表1。

表1 宫血宁口服给药后大鼠凝血参数TT、PT、APTT的改变

注:ˇP<0.05

2.2 宫血宁口服给药对小鼠外周血PLT数量的影响 血小板的主要功能是参与止血过程。血小板数量和功能障碍是导致出血的主要原因。表2示宫血宁口服给药对大鼠外周血血小板数量的影响。可以看出,同给药前血小板数相比,对照组血小板数量在给药后3天略有升高,7~17天有明显降低,治疗组在给药后3~14天血小板数均有升高,其 中以中剂量和小剂量组较为明显;同对照组相比,给药后3、7、14天宫血宁中剂量组、小剂量组血小板数明显高于对照组,而大剂量组在给药后10天反而低于对照组。这些结果表明,一定浓度的宫血宁口服给药可增加大鼠外周血血小板数量,这可能是宫血宁发挥其止血疗效的原因之一。见表2。

表2 宫血宁口服给药对小鼠外周血小板数量的影响

注:与对照组比较ˇP<0.05,ˇˇP<0.01,ˇˇˇP<0.001

2.3 宫血宁口服给药对大鼠血小板聚集功能的影响

表3 示宫血宁口服给药对2×10 -4mol/L ADP诱导血小板聚集作用的影响,ADP200μmol/L对大鼠血小板产生很强的聚集效果,聚集后不发生解离现象。从表中看出,给予宫血宁3天后,同对照组相比,大鼠血小板5min聚集率在各剂量组均有显著增强,其中以中剂量组效果最好,1min聚集率也有增加,中剂量组与对照组有明显差异。

表3 宫血宁口服给药对血小板聚集功能的影响

注:与正常组比ˇP<0.05,ˇˇP<0.01

3 讨论

机体通过血管收缩和血栓形成达到止血目的。在体内血栓形成中,首先有血小板的激活、聚集,形成白色血栓,同时激活的血小板释放促凝物质,启动体内凝血机制,使纤维蛋白原降解成纤维蛋白,纤维蛋白网络血液中的红细胞形成红色血栓,阻止血液流出血管。凝血因子和血小板的数量和功能是影响血栓形成的主要因素。APTT、PT和TT是检测内源性凝血、外源性凝血和凝血共同通路变化的主要筛选指标。给予宫血宁治疗后,发现APTT、PT和TT没有明显改变,说明宫血宁可能不影响凝血因子的生成或功能。

血小板由巨核细胞生成,每日以40×10 9 /L血液的速度更新,寿命只有7~11天。血小板生成受到血小板生成素和巨核细胞克隆刺激因子调控 [6] 。给予宫血宁后3天和5天小鼠外周血小板数量有较明显的升高,由于连续取血,随着给药后时间的延长,血小板数量趋于降低,但同对照组相比,宫血宁治疗组第14天和17天血小板数量亦有明显增加。因为我们只给药4.5天,血小板的生成周期是15天,因而可以推测宫血宁既能迅速动员骨髓血小板进入外周血,也对血小板的生成有促进作用。血小板聚集是血小板的一个主要功能。当血小板粘附于血管破损处或受到活化剂作用后既被活化,在钙离子的作用下,活化血小板膜GPⅡb-Ⅲa暴露出纤原受体,一个纤原分子可以同时和至少2个GPⅡb-Ⅲa结合,导致血小板聚集成团 [7] 。宫血宁口服给药3天后,大鼠血小板聚集功能显著增强,这结果表明,宫血宁口服给药可增强ADP诱导的血小板聚集,血小板聚集功能增强可能是宫血宁发挥止血作用的又一影响因素。

综上所述宫血宁口服给药对大鼠出凝血因子的生成或功能没有影响,使小鼠外周血小板数量增加、大鼠血小板聚集功能明显增强,表明宫血宁对血小板数量和功能的影响可能是其发挥止血作用的基础。

参考文献

1 韦建荣.反相高效液相色谱法测定宫血宁胶囊中偏诺皂甙类成分.药物分析杂志,1998,14:267-269.

2 何小红,方琳,等.宫血宁治疗药物流产术后出血的临床观察.中国实用妇科与产科杂志,2001,17(9):568.

3 汤荣光,陈廉.宫血宁治疗功能性子宫出血80例临床观察.医学科技,2001,3:42-43.

4 Zhang J,Meng Z,ZhangM,et al.Effect of six steroidal saponins isolated from anemarrhenae rhizoma on platelet aggregation and hemolysis in huˉman blood.Clin Chim Acta,1999,289(1-2):79-88.

5 Zhang H,et al.Mechanisms of hemolysate-induced[Ca 2+ ]i elevation in cerebral smooth muscle cells.Am J Physiol,1995,269(6Pt2):H1874-890.

6 Kaushansky K,Drachman JG.The molecular and cellular biology of thrombopoietin:the primary regulator of platelet production.Oncogene,2002,21(21):3359-3367.

7 Sharis PJ,Cannoo CP,Loscalzo J.the antiplatelet effects of t


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