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医用冲击波的细胞悬液模型

来源:INTERNET 作者:连惠波 郭宏骞 孙西钊 2005-6-24
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摘要: 冲击波损伤细胞的机制尚未完全搞清,这可能与应力效应、热力和空化效应以及自由基形成等因素有关 [1] 。在这一领域的研究中,细胞悬液模型具有显著的优势:实验方法比较简便 [2,3] 。能够控制和统一冲击波实验条件 [3] 。可以多次重复评价冲击波的细胞效应,这在动物模型中是很难实现的 [4] 。...


冲击波损伤细胞的机制尚未完全搞清,这可能与应力效应、热力和空化效应以及自由基形成等因素有关 [1] 。在这一领域的研究中,细胞悬液模型具有显著的优势:实验方法比较简便 [2,3] ;能够控制和统一冲击波实验条件 [3] ;可以多次重复评价冲击波的细胞效应,这在动物模型中是很难实现的 [4] 。以下介绍几种较常用的细胞悬液模型。

1 肾小管上皮细胞模型 [5]

冲击波(SWL)可引起产生肾小管功能的改变 [6~9] 。例如,在体外冲击波碎石术(ESWL)后,尿中的β 2 α 1 微球蛋白以及NAG等小分子蛋白升高,而尿中的TH蛋白则降低。 在SWL前、后测定细胞酶浓度的改变,也可以反映SWL所致的肾小管损伤程度 [10] 。根据这一原理,体外建立肾小管上皮细胞悬液模型,可用来观察高能冲击波(HESW)对肾小管上皮细胞的直接损伤作用,研究冲击波产生生物学效应的机制,在保证碎石效率的同时,减少副作用。同时,利用该模型亦可研究防止冲击波损伤肾小管的保护机制,例如,加入维拉帕米 [11] (苯烷胺类钙拮抗剂)、磷霉素 [12] (肾保护性抗体)以及硒 [13] (自由基清除剂)均能有效降低ESWL所致肾小管损伤的程度。

方法 [13] :将马-达犬肾(MDCK)细胞放在含有伊格儿(Eagle’s)培养基和胎儿牛血清(FCS)的培养瓶中生长。5~6天后,当它们形成“穹隆”时,加入胰蛋白酶,由此获得细胞悬液。MDCK细胞悬液(细胞浓度3×10 7 /ml)需放置在体积1.1ml的容器接受冲击波实验。为避免产生声学气-液界面,容器内必须充满细胞悬液。在接受冲击波实验之前和之后,分别测定培养基内细胞酶浓度的变化 [5] ,包括乳酸脱氢酶(LDH)和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)等细胞膜酶和细胞质酶,以及谷草转氨酶(GOT)和谷氨酸脱氢酶(GIDH)等线粒体酶。

实验 [5] 发现,细胞膜酶和细胞质酶的变化大于线粒体酶的变化。这可能由于细胞膜酶和细胞质酶变化先于细胞膜通透性发生轻微改变时即存在的缘故。形态学观察(台盼蓝染色)显示,低剂量冲击(16和18次)时,细胞破碎率低(8%和10%),高剂量冲击(128和256次)时,细胞破碎率显著增加(20%和24%)。

2 红细胞模型

通过观察SWL引起的瞬时细胞溶解作用,可以推测SWL对人体活性细胞的生物学效应及其影响冲击波损伤细胞程度的关键因素。因为红细胞只由细胞膜和血红蛋白组成,缺乏细胞内的器官和细胞膜修复能力,所以,当红细胞暴露于冲击波后,其释放出的血红蛋白量就能直接反映细胞损伤的程度 [14]

方法 [15] :取自人的新鲜全血被肝素化后,将红细胞放入磷酸盐缓冲液中(PBS,150ml Nacl,10ml磷酸钠,pH=7.4,同渗重摩290m0sm)离心后(1000g,10min)洗涤3次。测量离心后的细胞体积后,将细胞重新悬浮在PBS中,浓度达3.1%,制成的细胞悬液被放进2ml聚丙烯冷冻瓶中。

把聚丙烯瓶置于碎石机的焦点处,让冲击波通过瓶底进入细胞悬液,这样可以减少聚丙烯瓶对冲击波的扭曲效应。工作电压24kV(HM3型冲击波碎石机),冲击波剂量125次。接受冲击波实验后,细胞悬液在1000g离心10min,取上清液。通过分光光度计测定上清液血红蛋白浓度。为了评价细胞运动冲击波所致细胞损伤程度的影响,可以使用未肝素化的新鲜全血接受冲击波实验,进行对照 [14]

红细胞悬液模型是测试冲击波对细胞损伤程度的敏感指标。未完全充盈的样品瓶内红细胞几乎完全溶解(15mg/dl游离血红蛋白,而可以获得血红蛋白才16.7mg/dl);与之相比,完全充盈的样品瓶(消除气-液界面)内红细胞溶解则减少了80%;红细胞凝固的样品瓶内细胞溶解则减少了87% [14] 。显然,样品瓶内具有肉眼可视气泡,可影响冲击波细胞溶解的作用,因为直径1~3mm的微小气泡就能导致红细胞溶解增加,并且损伤程度与气泡直径成正比[15]

高压对冲击波细胞溶解具有抑制作用 [16] 。处于>80atm水静压下红细胞受冲击波损伤程度大大降低,但处于>120atm静水压(空化效应完全受抑制)下红细胞溶解反而达到97%。这提示,在空化效应完全被抑制时,非空化效应参与了红细胞的损伤作用,可能与应力效应有关。冲击波在非均一性物体中传播时产生的剪切力(应力),足以引起细胞和组织的损伤 [17] ,即使在那些冲击波不能产生空化效应的组织内,应力效应仍然存在。因此,空化效应并非冲击波致细胞损伤的唯一机制。

3 肿瘤细胞模型

肿瘤细胞具有很强的繁殖能力,当瘤细胞受到损伤甚至破裂时,其繁殖能力也随之减弱。通过研究HESW对肿瘤细胞的杀伤作用,可以探索治疗肿瘤的新途径。

方法举例 [18] :将RT4细胞(膀胱乳头状癌细胞)连续接种在RPMI-1640培养基上单层培养。该培养基由10%FCS,1%丙酮酸钠以及1%左谷氨酸提供营养,加用1%青霉素/链霉素,抑制细菌生长。该培养瓶内的细胞在含有50%CO 2 潮湿空气下保持37度,当成长为亚融合(subconfluˉence)的细胞后,再用PBS液(磷酸盐缓冲液)冲洗,用0.1%胰岛素/0.04%EDTA处理3min,采集到PBS液中。经过离心后,细胞重新被悬浮在培养基中。然后,接受电磁式碎石机冲击波实验,冲击次数1000次,焦区的能量密度0.3~0.6mJ/mm 2 ,频率1Hz。2周后,通过瘤落(至少含50个细胞)计数和细胞周期分析来评定冲击波对肿瘤细胞的杀伤作用。

离子化放射线、ATX-70、顺铂(cisplatin)和细胞素(cyˉtokines)可以增强冲击波对肿瘤细胞的杀伤作用 [18~20] 。如果盛放细胞悬液的样品瓶内出现气-液交界面,则显著增加了HESW细胞毒性作用 [14] 。这为探索肿瘤治疗的新方法提供了线索。此外,HESW致肿瘤细胞损伤的程度与冲击波类型、冲击波频率和肿瘤细胞类型有关。

4 模型评价和注意事项

为体现细胞悬液模型的优势,实验设计中一些关键因素必须加以考虑和统一:(1)由于气-液界面会增加冲击波的细胞毒性作用,进行冲击波实验时,必须完全充满样品瓶 [14];(2)气泡可作为空化核,增强冲击波空化效应的细胞毒性作用,故应清除样品瓶内一切肉眼气泡 [15] ;(3)悬液中的细胞浓度和细胞培养的时间是冲击波所致细胞损伤程度的影响因素;(4)在接受冲击波实验期间,如果细胞被固定于凝胶中,则冲击波损伤细胞的程度将大为降低 [21] ,这提示基质支持细胞是一个重要的保护因子,组织构成细胞将比悬液中的细胞损伤轻;(5)冲击波治疗参数,如工作电压、脉冲次数和频率以及样品在冲击波通路中的位置,也是影响细胞损伤程度的一个关键因素 [22] ;(6)盛放细胞悬液的样品瓶一般由聚丙烯制成,其声学特性接近水,容积要接近F 2 最大能量分布区的体积 [14] ,样品瓶外型也是冲击波细胞损伤模型中一个重要因素 [4] ,在相同实验条件下,平底瓶内冲击波细胞损伤程度高于圆底瓶;(7)冲击波所致细胞损伤程度与细胞类型有关 [15] ,例如,样品瓶具有肉眼可视气泡可增强冲击波溶解红细胞作用,但在相同条件下,对肾小管上皮细胞影响却不大;(8)通过外接适当装置,调整样品瓶内大气压,可以满足不同实验的要求 [23] ;(9)冲击波所致生物学目标损伤程度还与目标的形状有关,例如,在标准大气压下,直径100nm的磷脂膜囊接受冲击波实验时,所受的冲击波损伤和非治疗组差异无显著性;(10)模型实验需要设立适当的对照组,以做比较。在细胞悬液研究中,必须阐述以下参数:细胞类型,细胞通道数(number of cell passage),细胞培养时间,容器类型和充盈状况,细胞悬液浓度和体积。

总之,虽然利用细胞悬液或固定细胞模型能够研究冲击波对细胞的直接作用及根本机制,但是间接作用于肾小管细胞的肾血流也是影响冲击波作用的一个显著因素,细胞模型不能完全满足研究冲击波生物学效应所有方面的要求,其实验结果也和体内试验未必完全一致,例如,冲击波体内试验时,并未出现明显的红细胞溶解现象。因此,体外细胞研究并不能代替体内研究对碎石机性能的评价。

参考文献

1 Lokhard Walls M,SturteDant B.Fracture mechanisms model of stone comminution in ESWL and implications for tissue demage.Phys Med Biˉol,2000,45(1):1923-1942.

2 Kim HH.Effect of oxalate on the growth of renal tubular epithelial cells.Journal of endourology,2002,16(3):261-264.

3 Yilmaz Erdal,Batislam Ertan,Tugl


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