当前位置:首页 > 医源资料库 > 在线期刊 > 中华现代妇产科学杂志 > 2011年第8卷第1期 > Leptin对小鼠窗口期子宫内膜上皮细胞MMP-9及ICAM-1的影响*

Leptin对小鼠窗口期子宫内膜上皮细胞MMP-9及ICAM-1的影响*

来源:中华现代妇产科学杂志 作者:郝翠芳1,刘 萍2△,沈肖方1,张 宁1,王昕荣1 2011-6-30

摘要: 【摘要】 目的 研究瘦素(Leptin)对小鼠着床窗口期子宫内膜上皮细胞分泌金属蛋白酶-9(MMP-9)及细胞粘附分子-1(ICAM-1)的影响。 方法 离体培养着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞,用不同浓度Leptin干预,通过免疫组织化学SP法对子宫内膜上皮细胞MMP-9、ICAM-1蛋白的表达进行检测。 结果 (1)随着Leptin浓度的增加,原代培......


【摘要】  目的 研究瘦素(Leptin)对小鼠着床窗口期子宫内膜上皮细胞分泌金属蛋白酶-9(MMP-9)及细胞粘附分子-1(ICAM-1)的影响。 方法 离体培养着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞,用不同浓度Leptin干预,通过免疫组织化学SP法对子宫内膜上皮细胞MMP-9、ICAM-1蛋白的表达进行检测。 结果 (1)随着Leptin浓度的增加,原代培养的子宫内膜上皮细胞分泌MMP-9表达量呈浓度依赖性升高(P<0.01)。(2) 随着Leptin浓度的增加, 原代培养的子宫内膜上皮细胞分泌ICAM-1表达量呈浓度依赖性升高(P<0.01)。当浓度增加到一定水平ICAM-1的表达不再升高(P>0.01)。 结论 一定水平的Leptin可以促进子宫内膜上皮细胞MMP-9及ICAM-1的分泌,有利于胚胎着床。

【关键词】  瘦素;子宫内膜上皮细胞;免疫组化;金属蛋白酶-9;细胞粘附分子-1;小鼠

Objective To investigate the effect of Leptin on matrix metalloproteinases-9(MMP-9) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)secreted from endometrial epithelial cells during embryo implantation widow stage in mice.Methods Endometrial epithelial cells from mice in the embryo implantation stage were fertilized in vitro. The endometrial epithelial cells were treated with Leptin. The immunohistochemical method was applied to test the expression of MMP-9, ICAM-1 in the endometrial epithelial cells.Results With the increase in the concentration of Leptin, both the amount of MMP-9 secreted from the endometrial epithelial cells fertilized in vitro and the amount of ICAM-1 secreted from the endometrial epithelial cells fertilized in vitro increased in a dose-dependent manner(P<0.01).Conclusion It can be concluded that Leptin up to a certain level can increase the expression of MMP-9 and ICAM-1 secreted from endometrial epithelial cell in mice, thus improving embryo implantation.

  [Key words] Leptin; endometrial epithelial cells; immunohistochemical method;MMP-9; ICAM-1; mice

  近年的研究表明,多种细胞因子和激素在胚胎生长发育及妊娠母体中起着不可低估的调控作用。其中,瘦素(Leptin)是近年发现的Ⅰ型细胞因子,是肥胖基因的产物,由白色脂肪细胞分泌的一种含146个氨基酸的蛋白质。Margetic等[1]报道Leptin通过调节下丘脑-垂体-性腺的功能影响性激素的合成和分泌,也可通过直接或间接的外周作用对生殖系统功能产生影响,抑或通过直接结合卵泡细胞膜表面瘦素受体影响细胞的功能,但其具体机制尚不明了。本研究拟通过免疫组化方法检测围着床期小鼠子宫内膜上皮细胞在不同浓度Leptin作用下MMP-9、ICAM-1的表达量,以探讨Leptin在胚胎着床过程中的可能调控作用。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 实验动物

  成年昆明种雌性小白鼠,6~8周龄,体重25~30g。雄性3~4月龄,体重40~50g。由烟台绿叶生物制药公司实验动物中心提供[许可证号:SCXK(鲁)20030008]。实验动物房光、暗周期均为12h,饲养温度为 24℃~26℃,喂普通小鼠饲料,自由摄食饮水。

  1.1.2 试剂

  DMEM/F12培养基 (Hyclone,美国);胎牛血清(FBS)( Gibco,美国 );双抗(Hyclone,美国);孕马血清促性腺激素(PMSG)(宁波第二激素厂);人绒毛膜促性腺激素(HCG) (烟台北方制药厂) ;鼠重组瘦素(Leptin)(Sigma,美国);MMP-9、ICAM-1兔抗鼠单克隆抗体(武汉博士德);SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥);DAB 试剂盒(Invitrogen,美国)。

  1.2 方法

  1.2.1 小鼠子宫内膜细胞的原代培养与鉴定

  取成年雌性昆明种小白鼠,体重25~30g,4~5pm腹腔注射PMSG 10IU,48h后腹腔再注射HCG 10IU。雌雄按 2:1合笼 ,自然交配 ,次晨查见阴栓者定为妊娠第一天。取妊娠第四天雌鼠脱颈处死,按照石运芝[2]报道的方法培养上皮细胞并做鉴定。细胞计数以1×105/ml加入含10%灭活FBS的DMEM/F12培养液,接种于六孔培养板中(板内放有多聚赖氨酸包被的盖玻片)。置入37℃、95%空气、5%CO2培养箱中培养。

  1.2.2 加入Leptin进行调控

  24h细胞生长完全贴壁后,每孔更换含不同浓度Leptin的DMEM/F12的培养液1ml。设置正常对照组,每个组设五孔。培养液中Leptin浓度分别为10ng/ml、50ng/ml、500ng/ml。培养48h后,进行检测。

  1.2.3 细胞免疫组织化学染色

  取出盖玻片,PBS漂洗5min×3次,4%多聚甲醛室温下固定20min,PBS漂洗5min×3次,3%H2O2 室温下封闭15min,PBS漂洗5min×3次,10%的正常山羊血清37℃封闭30min;分别滴加一抗MMP-9(1:200)、ICAM-1(1:150),4℃冰箱内孵育过夜。滴加生物素化羊抗兔IgG(1:200),37℃孵育30min;PBS漂洗5min×3次,DAB 显色液显色10min;苏木素复染,中性树胶封片后显微镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗,其余步骤相同。

  1.3 图像处理和统计学分析

  采用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统对阳性细胞进行分析,每个组随机取5张片子,每张片子选择5个不重复视野定量分析,结果以阳性细胞数及平均光密度(OD值)表示。采用SAS统计软件(9.1.3版)分析实验结果,所获数据用x±s表示,进行方差分析及t检验

  2 结果

  2.1 Leptin对小鼠子宫内膜上皮细胞分泌MMP-9蛋白的影响

  见表1、图1。原代培养的着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞经10ng/ml、50ng/ml、500ng/ml Leptin处理后,分泌的MMP-9蛋白主要分布在上皮细胞胞质内。因为细胞表达的蛋白量不同,经DAB染色显示出深浅不同的棕黄色颗粒。与空白对照组相比,所有实验组MMP-9蛋白表达量都增加,差异有统计学意义(P<0.01);随着Leptin浓度的增加,上皮细胞MMP-9蛋白分泌量的增加,呈现一定的剂量效应关系,差异有统计学意义(P<0.01)。

  2.2 Leptin对小鼠子宫内膜上皮细胞分泌ICAM-1蛋白的影响

  见表1、图2。原代培养的围着床期小鼠子宫内膜上皮细胞经10ng/ml、50ng/ml、500ng/ml Leptin处理后,上皮细胞分泌的ICAM-1蛋白与二抗结合出现阳性反应,阳性产物呈棕黄色颗粒状,主要分布在上皮细胞胞质内。因为细胞表达的蛋白量不同,经DAB染色后显示出深浅不同的棕黄色颗粒。与空白对照组相比,随着Leptin浓度的增加,上皮细胞ICAM-1蛋白分泌量增加,呈现一定的剂量效应关系,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。当浓度达到500ng/ml时 ICAM-1的表达量不再增加,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。表1 不同浓度Leptin干预后小鼠子宫内膜上皮细胞MMP-9、ICAM-1表达

  3 讨论

  哺乳动物胚胎对子宫内膜的粘附和植入是非常复杂的生理过程。小鼠胚胎“着床窗”出现在妊娠第4~5天,持续24h左右,受到各种细胞因子、生长因子和激素凋节。MMP-9是MMPs家族成员之一,在早孕母胎表面的基质细胞、上皮细胞和蜕膜细胞中均有表达。具有酶解作用消化蜕膜基质、基底膜,在胚胎植入时溶解ECM以利着床[3]。哺乳动物模型研究表明,MMP-9对胚胎种植起重要作用。MMP-9敲除的小鼠生育力下降[4]。MMP-9抗体能阻止ECM降解,使囊胚生长停止,阻碍胚泡与子宫内膜上皮之间的粘附。可见,MMP-9在胚胎对子宫内膜着床中起着重要作用。实验中笔者用Leptin作为调控因素,探讨不同浓度的Leptin对着床窗口子宫内膜容受性的影响,发现随着Leptin浓度的增加,小鼠子宫内膜上皮细胞分泌MMP-9蛋白的表达量亦随之增加,具有量效关系。这与Gonzalez[5] 报道瘦素可以明显增强MMP-9的活性和国内徐可树[6]的研究是相符的。根据实验还得出,Leptin浓度在10~500ng/ml可使小鼠子宫内膜上皮细胞MMP-9的表达量稳步增长具有浓度依赖性关系。说明一定水平的Leptin可以与着床窗口期子宫内膜上皮细胞瘦素受体结合,通过影响MMP-9的表达,作用于滋养细胞识别粘附子宫内膜,并降解基质,侵入内膜从而参与胚泡着床。

  细胞粘附分子-1( ICAM-1)属于免疫蛋白超家族的主要成员,是一种重要的细胞粘附分子。在子宫内膜上皮细胞、蜕膜、滋养层细胞上均有表达。主要作用是介导细胞与细胞间的粘附,且对胚胎着床过程中介导子宫内膜容受性的建立和胚泡在子宫内膜的粘附发挥着重要作用。本文研究发现围着床期小鼠子宫内膜上皮细胞ICAM-1的表达随着Leptin浓度的增加,表达量逐步升高。Leptin的浓度在10~50ng/ml 之间时,可诱导ICAM-1表达上升,且具有浓度依赖性关系。据此可以看出一定浓度的Leptin可以上调ICAM-1的表达,促进其与配体如淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和巨噬细胞抗原复合体-1(Mac-1)等结合来介导胚泡与内膜间的粘附,且ICAM-1/LFA-1对话导致前炎性细胞因子迁移至着床位点,促使蜕膜的树突状细胞成熟,诱发局部辅助T细胞(Thl)增加并参与母胎面的免疫耐受形成,避免了子宫内膜对胚泡的免疫排斥作用,从而调节子宫内膜的容受性,进而有利于胚泡的着床。笔者研究还发现Leptin的浓度在500ng/ml时,ICAM-1的表达与对照组比较无差异。推断是否因为着床窗口期的子宫内膜因瘦素受体饱和从而不再刺激ICAM-1的表达,还值得进一步研究。

  (本文图片见封三)

【参考文献】
   1 Margetic S, Gazzola C, Pegg GG, et al. Leptin:a review of its peripheralactions and interactions. Int J Obes Relat Metab Disord, 2002, 26(11):1407-1433.

  2 石运芝,刘凯. 着床窗口小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养及形态学观察. 泰山医学院学报, 2004,6(25):570-572.

  3 Elsebeth Staun-Ram, Shlomit Goldman, Diana Gabarin,et al. Expression and importance of matrix metalloproteinase 2 and 9(MMP-2and -9) in human trophoblast invasion. Reprod Biol Endocrinol, 2004,2(1):59-61.

  4 Opdenakker G,Vanden Steen PE,Dubois B,et al.Gelatinase B functions as regulator and effector in leukocyte biology.J Leukoc Biol,2001,69(6):851-859.

  5 Gonzaiez RR,Devoto L,Campana A,et al.Effects of Leptin,interleukin-1α,interleukin-6,and transforming growth factor-on markers of trophoblast invasive phenotype:integrins and metalloproteinases.Endocrine,2001,15(2):157.

  6 徐可树,钟少平.Leptin对人早孕期滋养细胞CXCR-4、MMP-9及VEGF表达的影响.中国妇幼保健,2006,21(3):1108-1110.

  


医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《Leptin对小鼠窗口期子宫内膜上皮细胞MMP-9及ICAM-1的影响*》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有 苏ICP备12067730号-1
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: