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动态浊度法测定精氨酸中细菌内毒素的含量

来源:中华实用医药杂志 作者:顾炳仁 2011-6-29
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摘要: 【摘要】 目的 考察精氨酸细菌内毒素的定量分析方法。结果 将精氨酸配制成12。5mg/ml的溶液时进行定量测试效果满意。结论 可以用细菌内毒素定量测试浊度法替代家兔热原法来控制精氨酸的质量。...


【摘要】  目的 考察精氨酸细菌内毒素的定量分析方法。方法 按《中国药典》2005年版二部收载的动态浊度法进行试验。结果 将精氨酸配制成12.5mg/ml的溶液时进行定量测试效果满意。结论 可以用细菌内毒素定量测试浊度法替代家兔热原法来控制精氨酸的质量。

【关键词】  精氨酸;动态浊度法;细菌内毒素

精氨酸为氨基酸类药,主要功能为营养支持剂。标准采用家兔法检查其热原[1],本文采用检测细菌内毒素的动态浊度法,对精氨酸进行添加内毒素回收试验及与家兔热原法比较,初步建立了精氨酸的细菌内毒素定量检查方法,用于替代传统的家兔热原法。现小结如下。

  1 实验材料

         精氨酸:原料药,批号09011001、09011002、09011003(石家庄精晶药业有限公司,热原检查合格);细菌内毒素工作标准品,批号:150601-200862,效价120EU/支(中国药品生物制品检定所);鲎试剂(TAL)批号0901162、0806272,灵敏度(λ)为10~0.03EU/ml(湛江安度斯生物有限公司);细菌内毒素检查用水(BET水)批号090270,内毒素含量≤0.015EU/ml(湛江安度斯生物有限公司);EDS-99细菌内毒素测定系统(湛江正杰科学仪器有限公司)。

  2 方法与结果

  2.1 精氨酸的细菌内毒素限值(L)的计算[1] 根据精氨酸注射液的用法用量说明,其成人每次最大用量为10~20g,分4h滴完。精氨酸成人的最大用量为83mg/(kg·h),人体致热阈值 (K):5.0EU/kg,则精氨酸的L为:K/M=0.06EU/mg,结合精氨酸的热原剂量:(50mg/ml的溶液,10ml/kg),计算其L值为0.01EU/mg,考虑到安全因素,笔者认为规定精氨酸的L值以0.01EU/mg较为合理。

  2.2 细菌内毒素标准曲线的制备 取细菌内毒素工作标准品1支,用BET水将内毒素进行2倍稀释,使其最终浓度分别为1.0、0.5、0.250、0.125、0.0625、0.0312EU/ml的稀释系列,各取0.1ml分别加到预先加有0.1ml TAL的反应管内,混合均匀,插入EDS-99细菌内毒素测定系统内进行检测,每个浓度重复3管,结果见表1。标准曲线回归方程为:lgT=2.7416-0.3350lgC,r=-0.9887(>0.98),最低浓度为0.031EU/ml,且空白对照管的平均反应时间>3600s在检测时间外,因此标准曲线成立。表1 细菌内毒素标准曲线的制备

  2.3 内毒素回收试验 取精氨酸用BET水溶解,并分别稀释成每1ml溶液中含精氨酸50、25、12.5、6.2、3.1mg的溶液,记为Ai液;同时另取5管,进行同样的稀释,并在稀释液中添加内毒素浓度为0.25EU/ml的细菌内毒素标准溶液,记为Bi液,进行回收率试验。分别取上述各液0.1ml加入预先加有0.1mlTAl的反应管中,混合均匀,插入仪器内进行测定,每个浓度重复2管,计算平均回收率,结果见表2。表2 回收率试验(样品批号:09011001,n=2)

  2.4 干扰试验及样品内毒素测定 取3批精氨酸分别用BET水稀释成含12.5mg/ml的溶液,按“2.3”项方法进行试验,结果见表3。表3 精氨酸干扰试验及样品测定

  3 小结

  3.1 从表2精氨酸的干扰试验结果表明:样品在稀释成50mg/ml时已无干扰,而在12.5mg/ml时有更好的回收率。因此在日常检测时,选择12.5mg/ml浓度的溶液作为供试液。

  3.2 表3结果表明,3批样品浓度在12.5mg/ml时进行干扰试验及定量测试,结果内毒素回收率均在50%~200%范围内,样品的内毒素含量均小于0.00248EU/mg(0.031EU/ml/12.5mg/ml),样品内毒素含量符合规定。

  3.3 精氨酸中细菌内毒素定量检测的方法:取本品,用BET水溶解并稀释成每1ml中含精氨酸12.5mg的溶液,按《中国药典》2005年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法进行检查,每1mg精氨酸中含细菌内毒素的量不得过0.01EU。

  3.4 传统的家兔热原法操作繁琐费时,且影响的因素多,细菌内毒素凝胶法又只是一个限度检查,而定量法测定细菌内毒素的优点在于,能较正确地反映样品中内毒素的真实含量,且具有更低的检测下限,该方法值得推广应用。

【参考文献】
    1 国家药典委员会.中国药典,二部.北京:化学工业出版社,2005,831;附录85-88.

  


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