当前位置:Home > 医源资料库 > 在线期刊 > 中华实用医药杂志 > 2006年第6卷第9期 > 不同饲盐状态及L-Arg对SHR、WKY一氧化氮信号系统的影响

不同饲盐状态及L-Arg对SHR、WKY一氧化氮信号系统的影响

来源:中华实用医药杂志 作者:李素惠 2006-8-20
336*280 ads

摘要: 方法与结果 一氧化氮(Nitric Oxide, NO)信号系统由一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)、可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble Guanylyl Cyclase, sGC)和cGMP组成。本文将从以下两方面进行研究: (1)低盐、高盐、L-Arg对SHR、WKY靶器官的影响。结果:SHR组在给予L-Arg后血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量都显著增高,而......


  【摘要】  目的  探讨心血管病发病机制,有效地防治心血管病。方法与结果  一氧化氮(Nitric Oxide, NO)信号系统由一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)、可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble Guanylyl Cyclase, sGC)和cGMP组成。该系统在盐代谢、血管张力和血压调节方面发挥重要的作用。流行病学调查结果表明,高盐饮食是诱发高血压的危险因子之一,与原发性高血压的发病呈正相关。本文将从以下两方面进行研究: (1)低盐、高盐、L-Arg对SHR、WKY靶器官的影响。结果:SHR组在给予L-Arg后血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量都显著增高,而尿钠的排泄量变化不明显。对于SHR组,血压和尿钠的排泄量变化不明显,而血NO 和肾组织中cGMP含量明显升高。(2)采用RT-PCR技术,观察低盐、高盐、L-Arg 对WKY、SHR肾组织中sGC mRNA基因表达的影响。结果:L-Arg组,β1在WKY和SHR组均有明显的升高。结论  SHR组在给予L-Arg前,较对照组WKY的基础血压高;给予L-Arg后,血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量显著增高。提示我们:控制饮食中盐的摄入量对预防和治疗高血压病有显著疗效。
   
  【关键词】  低盐;高盐;L-Arg;sGC;SHR;NO;cGMP;RT-PCR
   
  心血管病是我国和全世界危害人类生命健康最严重的疾病之一,其患病率和死亡率均居各类疾病之首。探讨心血管病发病机制,从而更有效地防治心血管病是世界各国共同关注的重大问题。

  高血压是一种独立的疾病,同时又是多种心血管病共同的危险因素,它可以诱发动脉硬化、脑卒中和心肌梗死,引起心肾等多种靶器官功能衰竭。研究高血压发病中与盐代谢相关的信号系统对揭示其发病机制、探寻有效的防治措施,均有重要意义。

  一氧化氮(Nitric Oxide, NO)信号系统由一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)、可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble Guanylyl Cyclase, sGC)和cGMP组成。该系统在盐代谢、血管张力和血压调节方面发挥重要的作用。其中sGC 是NO重要的受体。Azam等应用连锁分析证实,sGC β亚单位基因是大鼠盐敏感高血压的相关基因。流行病学调查结果表明,高盐饮食是诱发高血压的危险因子之一。与原发性高血压的发病呈正相关。SHR大鼠由Okamoto和Aoki选育成功,SHR是一种遗传性高血压大鼠模型,其高血压的发病过程及主要病理变化与人类原发性高血压非常相似。本研究选用SHR和WKY大鼠为动物模型,给予高盐、低盐和L-Arg饲养,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从mRNA水平研究了SHR和WKY大鼠在高盐、低盐和L-Arg因素干预下,其肾脏组织中sGC的表达水平,为高血压的临床治疗提供理论指导。

  第一部分  高盐、低盐和L-Arg对SHR、WKY靶器官的影响

  1  材料

  1.1  药品  NaCl:市售分析纯;L-Arg:上海生物化学制药厂生产;磷酸二酯酶抑制剂(IBMX):Sigma公司提供。

  1.2  动物  10周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)和同龄同种系正常血压的京都种大鼠(WKY)各30只,体重200±18.2g,由中国医学科学院心血管病研究所实验动物科提供。喂养:高盐饮食组:给予高盐饮食,8% NaCl,分别用SHR-8%,WKY-8%表示;低盐饮食组:维持低盐饮食,0.45% NaCl,分别用SHR-0.45%,WKY-0.45%表示;L-Arg组:给予含2.25%的L-Arg的自来水饮用,分别用SHR-2.25%,WKY-2.25%表示。各喂养4周。

  2  方法

  2.1  监测指标

  2.1.1  血压测定  取安静清醒状态的血压,作为基础血压。每周测血压1次。

  2.1.2  尿Na+排泄量的测定  用电极法测定。

  2.1.3  血NO的测定  采用尾静脉取血法,4周末可采用断头取血法。

  2.1.4  肾组织cGMP的测定  采用上海中医药大学同位素教研室提供的cGMP放免试剂盒测定。

  2.2  数据处理  应用SPSS统计软件。所有数据均以x±s表示。

  3  结果

  3.1  低盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响  见表1。

  3.2  高盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响  见表2。

  3.3  L-Arg对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响  见表3。

  表1  低盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响  (略)

  表2  高盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响  (略)

  表3  L-Arg对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响  (略)
   
  SHR组在给予L-Arg前,较对照组WKY的基础血压高。给予L-Arg后,在WKY组,血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量均显著增高,而尿钠的排泄量变化不明显。对于SHR组,血压和尿钠的排泄量变化不明显,而血NO 和肾组织中cGMP含量明显升高。

  4  讨论

  SHR是一种遗传性高血压大鼠模型,是研究高血压常用和理想的动物模型之一[1]。本实验的结果说明了L-Arg对SHR组大鼠的血压有控制作用。摄入L-Arg,可增加细胞内L-Arg的含量。L-Arg具有明显的降压降脂作用,并可抑制动脉粥样硬化的形成。当高血压时NO的量会减少,如果给予L-Arg,通过L-Arg逆转非对称性二甲基精氨酸对一氧化氮合酶(NOS)的竞争性抑制,提高NOS活性,恢复NO的生成量,增加EORP/NO合成和释放,起到扩张血管作用。一氧化氮是一种强烈的内源性血管扩张剂,可直接舒张血管平滑肌细胞,降低血管张力,并抑制平滑肌细胞的慢性增殖,保护内皮细胞的完整。调节心肌细胞的变力变时作用,参与中枢神经系统对心血管的调节,起到降低血压的效果。实验结果显示:用L-Arg后,SHR的HCY下降(P<0.01),可能因为给予L-Arg恢复一氧化氮的生成,一氧化氮与HCY相互作用,形成无毒的S-亚硝基同型半胱氨酸可拮抗HCY增高时引起的毒副作用,减缓高血压血管病变的发生发展。高血压病致血管内皮受损伤后,其合成、释放的舒缩血管物质的功能也随之发生紊乱,其中最重要的NO和ET这一对相互作用、相互拮抗的舒缩血管因子。在体内NO是由NOS催化L-Arg和氧分子生成的,具有扩张血管、抑制血管平滑肌增殖和抑制血小板聚集的作用。

  一氧化氮信号系统是由一氧化氮合酶、可溶性鸟苷酸环化酶和cGMP组成。NO有着广泛的生理作用,例如依赖内皮的血管舒张调节血管张力降低血压、抑制血小板凝集、抑制血管平滑肌增殖和促尿钠排泄等。在生物体内,sGC是NO重要的受体。NO的许多生理作用都是通过sGC生成cGMP介导完成的。该系统在盐代谢和血压调节方面发挥着重要作用。 L-Arg通过增加NO的释放量,纠正NO/ET的平衡紊乱以及改善肾功能而发挥降血压的作用。

  第二部分  SHR在高盐、低盐及L-Arg干预下肾组织sGC mRNA的表达

  1  材料

  1.1  标本制备  实验处置4周末,对各组大鼠腹腔注射5%戊巴比妥钠35mg/kg,断头处死后,取双侧肾脏,用冰冷的生理盐水冲洗残余的血液,用滤纸吸干(在冰盘上操作),立即置于液氮内速冻,待转移到实验室后置于-70℃冰箱保存备用。

  1.2  仪器   (1)高速冷冻离心机(上海市离心机械研究所);(2)PCR仪(HYBAID EXPRESS);(3)桥式水平电泳槽(北京东方仪器厂);(4)电泳仪(EC-250);(5)垂直电泳仪(Bio-Rad);(6) 转移电泳仪(Bio-Rad);(7)恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂);(8)全自动数码成像系统及分析系统(英国SYNGENE公司GeneGenius系统)。

  1.3  主要药品及试剂  (1)trizol一步法试剂、MMLV反转录酶、OLIGO(dT)15、核糖核酸酶抑制剂等:GIBCO公司;(2)TaqDNA多聚酶、dNTPs等:TaKaPa生物工程有限公司;(3)DMEM合成培养基(DMEM  medium):GIBCO公司;(4)琼脂糖(电泳用):上海东海制药厂;(5)D-Hank's 液(g/L):NaCl 8.00, KCl 0.40, Na2HPO4 0.06, KH2PO4  0.35;(6)50×TAE缓冲液:Tris碱60.5g,Na2EDTA·2H2O 9.3g,冰乙酸14.3ml,双蒸水250ml。

  2  方法

  2.1  RT-PCR检测 sGC mRNA表达  (1)引物的设计与合成:引物参考Human Genome Mapping central database文献设计,由博亚公司合成。β1扩增片断全长260bp。β2扩增片断全长400bp。GADPH扩增片断全长605bp。(2)提取RNA,合成 cDNA的第一链。(3)聚合酶链反应(PCR)。(4)PCR扩增产物的凝胶电泳和产物分析。

  2.2  数据处理  结果用x±s表示,t检验进行统计学分析。

  3  结果

  从表4中可见正常饮食组sGC β1和β2的基因表达在WKY和SHY间差异无显著性(P>0.05);L-Arg组β1表达均有升高,WKY组基因表达高于SHR组(P<0.05),而β2表达两组无差别;高盐饮食组β1的表达较正常组明显降低,β2明显升高,且WKY组高于SHR组(P<0.01),而SHR组β2表达却高于WKY组(P<0.01);低盐饮食组较正常饮食组有所改变,但差异无显著性(P>0.05)。SHR、WKY在高盐、低盐及L-Arg作用下肾组织中可溶性鸟苷酸环化酶mRNA基因表达。

  表4  各组基因表达在WKY和SHY的比较  (略)

  4  讨论

  一氧化氮信号系统由一氧化氮合酶(NOS)、可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)和cGMP组成[1]。可溶性鸟苷酸环化酶催化三磷酸鸟苷(GTP)生成鸟苷酸环化酶(cGMP)。由于它是产生cGMP的两种酶之一(另一种为膜结合肽受体环化酶),所以sGC参与了许多重要的信号传导途径,特别是在心血管系统(如血管紧张度和血小板的功能调节)和神经系统(如神经递质传递)。SGC是由α、β亚单位组成的异二聚体蛋白,是一种血红素蛋白。SGC通过与NO结合而被激活。活化的sGC以及随后的cGMP浓度升高,使得NO/sGC信号向下传导,发生级联反应,从而激活cGMP依赖性蛋白激酶、cGMP门控型离子通道以及cGMP调控的磷酸二酯酶(PDE)。可溶性鸟苷酸激活后,促使GTP大量生成cGMP,cGMP和cAMP均为第二信使,通过靶蛋白起作用。其中NO/cGMP信使传导通路中有三个确定的靶向:cGMP依赖性蛋白激活酶、cGMP调空型磷酸二酯酶以及cGMP门控型离子通道。其一,对于cGMP依赖性蛋白激酶,其磷酸化靶蛋白随cGMP浓度升高而反应性升高。其二,环化鸟苷酸磷酸二酯酶催化、水解3-磷酸二酯酶-cAMP/cGMP,相应失掉AMP和GMP。其三,环核苷酸离子通道,是非特异性阳离子通道,存在与不同的组织(如视网膜和嗅觉上皮)。在生物体内,sGC是NO的重要受体,NO的生理作用如血管舒张、降低血压和促尿钠排泄等都是通过sGC生成cGMP介导完成的。作为联系NO和cGMP“纽带”的sGC,是一个异二聚体,由一个α亚单位和一个β亚单位构成。每个亚单位又有两种已知的同型异构体α1、β1、α2、β2[2],而β亚单位在sGC的活性方面起决定性作用。

  本实验表明,正常饮食的刺激低于β1/β2改变的阈值;而高盐饮食刺激大于β1/β2改变的阈值,同时在病变的自发性高血压大鼠反应更为强烈,与Ruetten H的报道一致[3]。在L-Arg组,β1在WKY和SHR组均有明显的升高,可能的解释为:sGC的调节活性与β亚单位两个异构体的构成比有关。实验发现,在α1/β2转染的COS7的细胞中,由 NO介导生成的cGMP仅为α1/β1转染的1/3,可以推测增加细胞中β2的表达,可降低接受NO激活的sGC活性[4]。研究发现,Dalh盐敏感大鼠肾脏中sGCβ2亚单位在mRNA和蛋白质水平的表达均增加,而β1亚单位基因表达减弱,提示Dalh盐敏感大鼠sGC对NO反应性降低,可能与其β亚单位基因水平的异常改变有关,即对NO不敏感的α1/β2表达增多和/或对NO敏感的α1/β1表达减弱。而对SHR和WKY的研究发现,在肾脏中sGC表达两者无差别。 一方面增加NOS合成NO的低物,提高NOS活性,从而增加NO 的合成和释放;另一方面,β1基因表达的上调,可增强接受NO激活sGC活性。两者共同作用下使肾组织中cGMP增加。通过PKG调节Na+-K+-ATPase活性,降低水、钠重吸收,还可通过抑制近曲小管Na+-H+交换,调节Na+-K+-ATPase以及降低肾小球前小动脉阻力血管的阻力而引起钠排泄增加,起到降低血压的作用[5]。对于高盐饮食组,恰好与L-Arg组相反,β1表达较正常饮食组明显降低,而β2表达则明显增高。从而降低sGC活性,cGMP生成量减少。同时,高盐饮食致高血压病者内皮损伤,血中ET浓度增加,NO浓度降低。以及肾脏损伤而致水、钠潴留,从而引起血压升高。低盐饮食组β1、β2表达对于正常饮食组有不同程度的改变,但无统计学意义,这表明在低盐组引起血压升高的因素中,β1/β2的改变不起主要作用[6]。

  综上所述,β1/β2基因在不同刺激因素下的改变,可部分解释NO-sGC-cGMP系统与高血压之间的关系,对β1/β2在心、主动脉及脑等器官中随外界刺激因素改变有何变化,还需进一步研究。

  第三部分  全文总结

  一氧化氮(Nitric Oxide,NO)信号系统由一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)、可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble Guanylyl Cyclase,sGC)和cGMP组成。该系统在盐代谢、血管张力和血压调节方面发挥重要的作用。本文通过观察在低盐、高盐、L-Arg干预下,SHR、WKY靶器官的变化以及对肾组织中sGC mRNA基因表达的影响。

  研究发现,给予L-Arg后,在WKY组,血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量都显著增高,而尿钠的排泄量变化不明显[7]。对于SHR组,血压和尿钠的排泄量变化不明显,而血NO 和肾组织中cGMP含量明显升高。正常饮食组sGC β1和β2 的基因表达在WKY和SHY间差异无显著性;L-Arg组β1表达均有升高, WKY组基因表达高于SHR组,而β2表达两组无差别;高盐饮食组β1的表达较正常组明显降低,β2明显升高,且WKY组高于SHR组,而SHR组β2表达却高于WKY组;低盐饮食组较正常饮食组有所改变,但差异无显著性,且无统计学差别。
这提示我们L-Arg可以通过NO-sGC-cGMP系统起到降低血压的作用。

  【参考文献】

  1  S-C Kuo, FY Lee, C-M Teng.United States Patent No,1996,5(574):168.

  2  T Ingi, J Cheng, GV Ronnett, Carbon monoxide: an endogenous modulator of the nitric oxide-cyclic GMP signaing system. Neuron,1996,16:835-842.

  3  A Verma, DJ Hirsch, CE Glatt, et al. Carbon mo-noxide: a putative neural messenger, Science,1993,259:381-384.

  4  R Zakhary, KD Poss, SR Jaffrey, et al. Targeted gene deletion of hems osygenase 2 reveals neural rose for carbon monoxide.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:14848-14853.

  5  JR Stone, MA Marietta. Soluble guanylate cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterization of the ferrous and ferristates. Biochemistry,1994,33:5636-5640.

  6  JR Stone, MA Marietta. Synergistic activation of soluble guanyiate cyclase by'YC-1 and carbon monoxide; implications for the role of cleavage of the iron-histidine bond dur ing activation by nitric oxide. Chem Biol,1998,5:255-261.
 
  7  A Friebe, G Schultz, D Koesling. Sensitizing soluble gua- nylyi cyclase to become a highly CO-sensitive enzyme.EMBO J,1996,15:6863-6868.

  作者单位: 300162 天津,武警医学院附属医院 

  (编辑:齐  永)


医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《不同饲盐状态及L-Arg对SHR、WKY一氧化氮信号系统的影响》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: