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甘油三酯对体外培养大鼠胰岛细胞功能及细胞内游离钙的影响

来源:中华实用医药杂志 作者:朱姿英,薛耀明,舒子正,鞠海兵,胡灯明 2006-8-20
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摘要: 【摘要】 目的 观察甘油三酯对体外培养大鼠胰岛细胞分泌功能及对细胞内钙离子平均荧光强度的影响。方法 体外分离SD大鼠胰岛细胞进行单层细胞培养,与不同浓度甘油三酯(0、0。0 mmol/L)共同孵育72h,进行葡萄糖负荷试验,放射免疫法检测培养液中胰岛素水平,以评价胰岛细胞功能变化。采用Flou-3/AM荧光染色法,共聚焦显......


  【摘要】  目的  观察甘油三酯对体外培养大鼠胰岛细胞分泌功能及对细胞内钙离子平均荧光强度的影响。方法  体外分离SD大鼠胰岛细胞进行单层细胞培养,与不同浓度甘油三酯(0、0.25、2.5、5.0、10.0 mmol/L)共同孵育72h,进行葡萄糖负荷试验,放射免疫法检测培养液中胰岛素水平,以评价胰岛细胞功能变化;采用Flou-3/AM荧光染色法,共聚焦显微镜下观察细胞内钙离子荧光强度的强弱,以间接反映细胞内游离钙的水平。结果  5.0、10.0mmol/L甘油三酯可抑制胰岛细胞的高糖刺激下的胰岛素分泌(P<0.05);甘油三酯组(2.5、5.0、10.0 mmol/L)细胞内钙离子平均荧光强度均明显增强,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论  甘油三酯可以导致胰岛细胞内游离钙水平异常升高,影响细胞的分泌功能。

  【关键词】  甘油三酯 ;2型糖尿病;胰岛细胞;钙离子;Flou-3/AM
  
  Effect of triglycerides on function and intracellular free calcium of rat islet cells in vitro

  ZHU Zi-ying, XUE Yao-ming,SHU Zi-zheng,et al.

  Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China

  【Abstract】  Objective  To study the effect of triglycerides(TGs) on function and intracellular free calcium of rat islet cells in vitro.Methods  Islet cells of SD rat were separated for monolayer cell culture and were treated with defferent concentrations of TGs (0、0.5、2.5、5.0、10.0 mmol/L)for 72 h. Insulin level in the cell culture media was measured after glucose load test. Meanwhile the Flou-3/AM was applied to probe intracellular free calcium concentration and the fluorescent intensity was detected using confocal microscopy technique. Results  High glucose(27.8 mmol/L)-induced insulin secretion was inhibited by 5.0 mmol/L TGs or 10.0 mmol/L TGs; fluorescent intensity in TGs groups(2.5、5.0、10.0 mmol/L) was significantly higher than that of control group.Conclusion  TGs induces intracellular free calcium elevation in intro islet cells, and has a inhibitory effects on the cell function.

  【Key words】  triglycerides; type 2 diabetes mellitus; calciumion;Flou-3/AM

  高甘油三酯血症是2型糖尿病最常见的脂代谢异常,也是2型糖尿病发病的独立危险因素。2型糖尿病的发生是胰岛细胞功能逐渐衰竭的过程,Ca2+与胰岛细胞的功能密切相关。本实验以体外培养的大鼠胰岛细胞为对象,观察甘油三酯对胰岛细胞功能及细胞内基础游离Ca2+水平的影响。

  1  材料与方法

  1.1  主要试剂  Ⅴ型胶原酶(Sigma公司产品);甘油三酯(20%Intalipid)(Sigma公司产品),以完全培养基稀释成所需浓度;荧光探针Flou-3/AM(Sigma公司产品); 1640基础培养基(Gibco公司产品);胎牛血清(杭州四季清产品);胰岛素放射免疫试剂盒由北京原子能研究院同位素研究所提供。

  1.2  胰岛细胞分离、纯化、培养  取出生1~3日SD(Sprague-Dawley)大鼠(雌雄不拘,由本院动物所提供),常规消毒,剖腹取出胰腺,置于4℃Hanks液中,用眼科剪将其剪成0.5mm3组织块,3mg/mlⅤ型胶原酶(pH 7.4)进行消化,37℃水浴中消化6~8min,取上层浊液,4℃ Hanks液终止消化,未消化组织如此反复消化4~5次,至组织基本消化。收集各次消化浊液,1000rpm离心5min,取沉淀加入完全培养基调整细胞密度,接种进行单层细胞培养。16 h后转皿去除成纤维细胞,于24孔板(5×105细胞/孔)及30mm培养皿中继续培养7天,可用于实验。

  1.3  实验设计  取24孔板中生长良好的胰岛细胞分为5组,培养液中甘油三酯终浓度分别为0、0.5、2.5、5.0、10.0 mmol/L,每组设4个复孔,37℃、5%CO2孵育72 h,行葡萄糖刺激胰岛素分泌试验,测定相应介质中胰岛素含量;取4个35mm培养皿中的胰岛细胞,培养液中甘油三酯浓度分别是0、2.5、5.0、10.0 mmol/L,37℃、5%CO2孵育72 h,Flou-3/AM进行荧光染色,共聚焦显微镜下观察。

  1.4  葡萄糖刺激的胰岛素释放试验  不同处理的胰岛细胞,弃去原培养液,分别用含葡萄糖2.8 mmol/L及含葡萄糖27.8 mmol/L的KRBB(Kerbs-Ringer bicarbonate buffer)液在37℃、5%CO2孵育箱中孵育1h,分别收集刺激后的培养液,采用放射免疫双抗体法,通过γ-计数仪,检测胰岛素分泌量。

  1.5  Flou-3/AM荧光染色  经过处理后的胰岛细胞,弃去原培养液,用Hanks液洗涤两遍,加入终浓度为5μmol/L Flou-3/AM染液,37℃孵育45 min。染色结束后,再用PBS缓冲液洗涤3次,准备上机扫描。

  1.6  共聚焦显微镜观察  Flou-3/AM染色后的胰岛细胞,置于共聚焦显微镜下,40倍光学显微镜下选择观察区域,由共聚焦显微镜观察Flou-3/AM染色后的胰岛细胞某一层面的荧光图像。其中每个处理组选取大约30左右个细胞,记录荧光强度值。共聚焦显微镜通过显微镜发出的488nm波长的氩离子激光,激发细胞内与染液结合的游离Ca2+,产生荧光。荧光信号通过计算机系统进行数据分析,可以反映细胞内Ca2+的分布、含量信息。

  1.7  统计学处理  实验数据统计以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS统计软件。用one-way ANOVA检验方差齐性, 组间两两比较用Student-Newman-Keul检验。

  2  结果

  2.1  甘油三酯对胰岛细胞胰岛素分泌的影响  在低糖(2.8 mmol/L Glu)刺激下,胰岛素分泌量差异无显著性(P>0.05),在高糖(27.8 mmol/L Glu)刺激下胰岛素分泌量差异有显著性(P<0.001)。高浓度甘油三酯组(5 mmol/L、10 mmol/L)与对照组比较,胰岛素分泌量显著降低(P<0.05);较低浓度甘油三酯组(0.5 mmol/L、2.5 mmol/L)与对照组比较,胰岛素分泌量差异无显著性(P>0.05)。高浓度甘油三酯组胰岛素分泌量较低浓度甘油三酯组有明显下降(P<0.05),见表1。

  表1  不同浓度甘油三酯作用下胰岛素释放量测定  (略)

  注:与对照组比较*P<0.05,与0.5mmol/L组比较#P<0.05,与2.5mmol/L比较ΔP<0.05

  2.2  甘油三酯对胰岛细胞内Ca2+平均荧光强度影响  各处理组胰岛细胞内钙离子平均荧光强度差异存在显著性(P<0.05)。与对照组相比,甘油三酯组细胞内钙离子平均荧光强度均明显增强(P<0.05);随甘油三酯浓度的升高,细胞内钙离子平均荧光强度也逐渐增强,但组间差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

  表2  甘油三酯对胰岛细胞内Ca2+平均荧光强度影响  (略)

  注:与对照组比较*P<0.05

  3  讨论

  2型糖尿病患者的脂代谢紊乱以高甘油三酯血症最为常见[1]。近年来国内外的一些前瞻性研究[2~4]表明血甘油三酯水平增高是2型糖尿病发病的独立危险因素,二者之间的关系近年来受到重视。目前多认为与胰岛素抵抗有关,而Zhi-Wei Man[5]等对糖尿病大鼠的体外实验结果表明甘油三酯对胰岛细胞的分泌功能也有明显的抑制作用。本实验以原代培养的正常胰岛细胞为对象,观察到在甘油三酯持续下,细胞的分泌功能受到一定程度的影响:即高糖(27.8 mmol/L)负荷下,高浓度甘油三酯组(5.0、10.0 mmol/L)明显抑制胰岛细胞的胰岛素分泌。提示高浓度甘油三酯对胰岛细胞功能具有直接的损伤作用。

  胰岛细胞的分泌功能是一个依赖钙离子的过程,在B细胞刺激-分泌偶联中,细胞内钙离子起了非常重要的作用,许多研究[6~8]也证实了这一点。Anneli等[9]将人的胰岛细胞分别与5.5和27 mmol/L的葡萄糖体外培养48 h,发现后者对27 mmol/L葡萄糖刺激的胰岛素分泌失去反应的同时,出现细胞内游离钙的明显异常,主要表现为细胞内基础游离钙水平的升高及葡萄糖刺激后细胞内游离钙升高缺如。那么细胞内游离钙的慢性持续升高状态是怎样形成?对胰岛细胞分泌功能又会产生什么样的影响呢?Kohtari等学者[10]认为生理条件下,葡萄糖浓度的升高引起胰岛细胞钙离子内流,触发胰岛素分泌出胞,当葡萄糖浓度下降时,细胞内钙离子水平即恢复基础值。若高葡萄糖状态持续存在,就可能导致细胞内基础游离钙也维持高水平。他们以两种胰岛B细胞株为研究对象,一种是对葡萄糖敏感细胞株MIN6-m9,其功能与正常胰岛细胞相似,另一种是对葡萄糖不敏感细胞株MIN6-m14,分泌功能低下,且细胞内基础游离钙水平明显高于MIN6-m9,而钙离子拮抗剂nifedipine能够使MIN6-m14细胞内游离钙恢复正常,细胞功能增强。提示胰岛细胞内基础游离钙水平升高与细胞分泌功能的减低密切相关。本实验采用Flou-3/AM荧光染色法[11]显示胰岛细胞内游离钙荧光强度,从而间接反映胰岛细胞内基础游离钙的含量。结果发现经高浓度甘油三酯长期处理后,胰岛细胞内平均荧光强度与对照组相比均明显增强,提示甘油三酯组细胞内基础游离钙水平明显增高。因此,认为长期高浓度甘油三酯可以导致胰岛细胞内游离钙水平异常升高,影响细胞的分泌功能。
 
  【参考文献】

  1  叶平.血脂的基础与临床. 北京:人民军医出版社,2002, 191-200.

  2  Sane T, Taskinen MR. Does familial hypertriglyceridemia predispose to NIDDM ? Diabetes Care, 1993,16: 1494.

  3  Montenegro RM Jr, Montenegro AP, Fernandes MI, et al. Triglyceride-induced diabetes mellitus in congenital generalized lipodystrophy. J Pediatr Metab,2002, 15: 441-447.

  4  杨文英,邢小燕,林红,等.高甘油三酯血症是非胰岛素依赖型糖尿病发病的危险因素. 中华内科杂志,1995, 34:583-586.

  5  Zhi-Wei Man, Min Zhu, Yoshihiko Noma, et al. Impaired B-cell function and deposition of fat droplets in the pancreas as a consequence of hypertriglyceridemia in OLETF rat, a model of spontaneous NIDDM. Diabetes, 1997, 46:1717-1724.

  6  Jean ?Claude Henquin, Christian Boitard, Suad Efendic, et al. Insulin secretion: movement at all levels. Diabetes, 2002, 51(1):1-2.

  7  Mitsuhisa Komatsu, Hiroki Yajima, Satoko Yamada, et al. Augmentation of Ca2+-stimulated insulin release by glucose and long-chain fatty acids in ret pancreatic islets Free fatty acids mimic ATP-sensitive K+ channel-independent insulinotropic action of glucose. Diabetes, 1999, 48: 1543-1549.

  8  Yoshimasa Okamoto, Hitoshi Ishida, Tomohiko Taminato, et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucise of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes, 1992, 41: 1555-1561.

  9  Anneli Bjorklund, Anders Lansner, Valdemar E.Grill. Glucose-induced [Ca2+]I abnormalities in human pancreatic islets. Diabetes, 2000, 49: 1840-1848.

  10  Kohtaro Minami, Masaaki Yokokura, Nobuko Ishizuka, et al. Normalization of intracellular Ca2+induces a glucose-responsive state in glucose-unresponsive B-cells. J Biol Chem, 2002, 277(28): 25277-25282.

  11  李楠,王俊玫,杨军,等.激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙的方法.中国体视学与图像分析,1997,2(3):188-191.

  (编辑:罗  彬)

  作者单位:650032 云南昆明,成都军区昆明总医院血液内分泌科

       510515 广东广州,南方医院


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