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茜草提取物联用5-Fu对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡及抗增殖作用的实验研究

来源:中华实用医药杂志 作者:朴成哲,孙东植,金梅红,宋京郁 2006-8-20
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摘要: 【摘要】 目的 探讨茜草提取物联用5-Fu对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡、抗增殖作用及凋亡前后bcl-2基因表达的影响。方法 通过MTT法、透射电镜观察法、DNA电泳法、TUNEL法、免疫细胞化学法等方法,从形态学、生物化学及免疫细胞化学等三个方面进行研究。结果 茜草提取物在0。0mg/ml范围内,5-Fu在2~16μg/ml范围内对胃癌......


  【摘要】  目的  探讨茜草提取物联用5-Fu对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡、抗增殖作用及凋亡前后bcl-2基因表达的影响。方法  通过MTT法、透射电镜观察法、DNA电泳法、TUNEL法、免疫细胞化学法等方法,从形态学、生物化学及免疫细胞化学等三个方面进行研究。结果  茜草提取物在0.2~1.0mg/ml范围内,5-Fu在2~16μg/ml范围内对胃癌MGC-803细胞均有抑制作用,并表现出浓度依赖性关系;两种药物联合作用时,其抑制率高于单独用药。茜草提取物、5-Fu各自作用于胃癌MGC-803细胞株后,可见明显的凋亡形态学变化,细胞凋亡率(APO%)随各自药物浓度升高而增加,当药物作用达48h时,APO%达高峰,两种药物联合作用时,其APO%高于单独用药。用0.4mg/ml茜草提取物作用24h时,DNA电泳出现梯形电泳条带。增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达率随两种药物各自浓度的提高和时间的延长而降低,两种药物联合作用时,其阳性表达率的降低更为明显。0.8mg/ml茜草提取物作用于胃癌MGC-803细胞48h时,明显下调bcl-2基因蛋白表达。结论  茜草提取物对胃癌MGC-803细胞株有诱导凋亡和抗增殖作用;茜草提取物与5-Fu联合作用时,其作用明显增强。茜草提取物诱导胃癌MGC-803细胞株凋亡的分子生物学机制可能与下调凋亡抑制基因bcl-2表达有关。

  【关键词】  茜草提取物;5-Fu;胃肿瘤;细胞凋亡;细胞增殖;PCNA;bcl-2
   
  Studies on anti-proliferation and inducing apoptosis of the extract of Rubia Cordifolia L with 5-Fu for MGC-803 cell line of gastric carcinoma

  PIAO Cheng-zhe,SUN  Dong-zhi,JIN Mei-hong,et al.

  Department of Pathology,Yanbian University College of Medicine,Yanji 133000,China

  【Abstract】  Objective  To study the effects of the extract of Rudia Cordifolia L with the 5-fluorouracil(5-Fu)for MGC-803 cell line of gastric carcinoma for inducing apoptosis(APO),anti-proliferation and expression of bcl-2 gene before and after APO.Methods  Using the MTT assay,transmission electric microscope(TEM),DNA-Ladder method,TUNEL method and immunocytochemistry,the inducing APO and anti-proliferation of the extract of Rudia Cordifolia L with the 5-Fu for MGC-803 cell line of gastric carcinoma were studied in morphology,biochemistry and immunocytochemistry.Results  0.2~1.0mg/ml of the extract of Rudia Cordifolia L and 2~16μg/ml 5-Fu had inhibition for MGC-803 cells of gastric carcinoma with the relationship of concentration dependence,and was obviously increased when using two combined medicine.After MGC-803 cells of gastric carcinoma were treated with the extract of Rublia Cordifolia L and 5-Fu separately,significantly apoptotic morphological changes were observed,and the APO rate was increased with increasing of the medicine concentration respectively.The APO rate was the highest at 48h of culture with medicine,but it was gradually decreased along with the time of culture,and the APO rate of using two combined medicine was higher than that of using single medicine.The extract of Rublia Cordifolia L and  5-Fu decreased the positive expression rate of PCNA with increasing of the medicine concentration and the time of culture respectively,the positive expression rate of PCNA with using two combined medicine decreased more obvious.After administrating the 0.8mg/ml of the extract of Rubia Cordifolia L to MGC-803 cells for 48h,the positive expression rate of bcl-2 was obviously decreased.Conclusion  The extract of Rublia Cordifolia L has the effects of inducing APO and anti-proliferation for MGC-803 cells,and when administrating with 5-Fu,the extract of Rublia Cordifolia L obviously enhanced the effects of anti-proliferation and inducing APO of 5-Fu,the mechanism of molecular biology of the extract of Rubia Cordifolia L for inducing APO of MGC-803 cells may be correlated with down regulatory apoptosis inhibitory genes.

  【Key words】  Rubia Cordifolia L extract;5-fluorouracil;stomach neoplasms;apoptosis;cell proliferation;PCNA;bcl-2

  茜草(Rubia cordifolia L.)为我国传统中药,具有行血、止血、通经活络、止咳祛痰等功效[1],1982年,日本学者系川秀治等发现从中国上海购进的茜草和日本产刺茜草(R.akane)的甲醇提取物有抗癌作用,其化学结构均为环己肽(RA)[2],动物实验还发现RA对P388白血病、B-16黑色素瘤、实体瘤中的结肠癌38、艾氏癌及Lewis 肺癌均有抗癌作用,RAV对MM-2乳腺癌有效,RA-Ⅶ还能防止癌细胞转移[3]。但茜草联合化疗药物对胃癌细胞株的抑制作用尚未见报道。因此,本实验利用MTT法、透射电镜观察法、DNA电泳法、TUNEL法,免疫细胞化学法等,研究了茜草提取物、5-Fu及两种药物联合作用时,对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡和抗增殖作用,为茜草的抗胃癌作用及其联合化疗药物治疗胃癌提供了实验依据。

  1  材料与方法

  1.1  胃癌细胞株和主要试剂  人胃癌MGC-803细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供,本教研室多年冻存在液氮中,临用前复苏后进行实验。茜草提取物由延边大学药学院天然药物教研室提供。5-Fu为上海旭东海普药业有限公司产品。RPMI-1640为GIBCO公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。蛋白酶K为德国Boehringer公司产品。噻唑盐(MTT)为美国SIGMA公司产品。PCNA、bcl-2检测试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品。TUNEL 检测试剂盒为德国Boehringer 公司产品。其他试剂均为分析纯产品。

  1.2  体外细胞复苏与培养  人胃癌MGC-803细胞株用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,在37℃、5%CO2条件下常规培养。胃癌细胞传代至生长旺盛,于实验前24h半量换液,用0.4%台盼蓝染色3min,观察活细胞。本实验所用的细胞活性均在98%以上。

  1.3  细胞分组及药物处理  胃癌细胞随机分为三大组,分别为茜草组、5-Fu组、联合用药组;每大组又分为五个小组,分别为对照组1个,实验组4个,每个小组分别培养12h、24h、48h、72h时观察细胞的变化;对照组不加药,茜草组在每个时间点均有0.2、0.4、0.8、1.0mg/ml茜草提取物剂量组,5-Fu组在每个时间点均有2、4、8、16μg/ml 5-Fu剂量组,联合用药组加药量为茜草组与5-Fu组加药量的半量。

  1.4  药物毒性实验  采用MTT快速比色法,计算药物抑制率,同时获得50%抑制率(ID50)的药物浓度。

  药物抑制率(%)={1-(实验组A值-试剂对照组A值)/(对照组A值-试剂对照组A值)}×100%,A值为490nm实验波长下测定的每孔的光吸收值。

  1.5  DNA断裂分析  酚氯仿法抽提各组胃癌细胞DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯形条带。

  1.6  透射电镜观察  收集细胞,经戊二醛和四氯化锇固定,梯度酒精脱水,Epon-812包埋,在超薄切片机上切成薄片,醋酸钠和柠檬酸铅染色,JEM-1200EX型透射电镜观察。

  1.7  涂片细胞检测

  1.7.1  制作细胞涂片  在无菌条件下制备细胞悬液,细胞浓度为2×105个/ml,按上述分组给药并培养至所需时间点收集细胞。用吸管轻轻吹打使细胞悬浮,吸出一定量的悬液注入离心管中,1200rpm/min,离心10min,并重复2次,用0.1ml PBS重新悬浮细胞,取10μl细胞悬液均匀涂布于载玻片上,涂布范围为直径1.0cm,4%多聚甲醛固定,待做HE、TUNEL、PCNA、bcl-2等染色。

  1.7.2  HE染色  按常规做HE染色,光镜下观察。

  1.7.3  TUNEL染色  实验操作按宝灵曼公司试剂说明书进行,并略加修正。染色后,在真彩病理细胞图像分析系统中求得凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)。结果判断:在TUNEL染色中细胞凋亡阳性物质呈棕黄色,位于细胞核内。计算APO%,随机选取10个高倍视野,分别记数凋亡细胞和总细胞数,APO%=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

  1.7.4  免疫细胞化学染色  实验操作按S-P试剂盒说明书进行,并略加修正。染色后,在真彩病理细胞图像分析系统中求得增殖细胞(PCNA阳性细胞)和bcl-2阳性细胞。结果判断:PCNA阳性物质呈棕黄色,位于细胞核内;bcl-2阳性物质呈棕黄色,主要位于胞浆内,细胞膜和核膜也有少量着染。计算阳性表达率,每组随机取5个统计场,其平均值作为PCNA或bcl-2的阳性表达率。

  1.8  统计学处理  MTT法检测的抑制率之间的比较采用χ2检验;APO%与PCNA、bcl-2阳性表达率的组间平均率的比较采用t检验。

  2  结果

  2.1  用MTT法检测药物对胃癌MGC-803细胞株的生长抑制作用  茜草提取物在0.2~1.0mg/ml范围内,5-Fu在2~16μg/ml范围内对胃癌MGC-803细胞株均有抑制作用,并表现出浓度依赖关系,各浓度之间的抑制度差异均有显著性(P<0.05或P<0.01),茜草的ID50浓度为1.0mg/ml。两种药物联合作用时,其抑制度高于单独用药组,差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。见图1。

  2.2  透射电镜观察  对照组细胞表面有微绒毛,胞质密度高,细胞器正常,核常不规则,核仁大,可有多个核仁,常染色质丰富,染色质均匀。实验组多数细胞微绒毛消失,胞浆有空泡出现,常染色质溶解,异染色质增多,部分细胞核染色质固缩,有的碎裂成数个团块,还可见细胞出芽,膜包裹的凋亡小体凸出细胞;也可见一些细胞膜破裂,内容物外溢等改变。见图2、3。

  2.3  DNA电泳  紫外灯下观察,对照组和实验组DNA均在入胶处有一相同分子量大小的亮带,用0.4mg/ml的茜草提取物作用24h时和0.4μg/ml茜草提取物+4mg/ml 5-Fu作用24h时,上述亮带减少,并出现不连续的梯形电泳条带。见图4。

  2.4  TUNEL法检测药物对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡作用  茜草提取物、5-Fu各自作用于胃癌MGC-803细胞株后,APO%随药物浓度的增高而升高,当药物作用达48h时APO%达高峰,以后随培养时间的延长凋亡细胞逐渐减少,坏死细胞却逐渐增多。茜草浓度1.0mg/ml时和5-Fu浓度2μg/ml时48h与72h之间差异无显著性外,其余不同浓度与不同作用时间的APO%差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。两种药物联合作用时,其APO%高于单独用药组,但同一时间组内茜草提取物0.2mg/ml+5-Fu 2μg/ml与茜草提取物0.1mg/ml+5-Fu 1μg/ml相比差异无显著性(P>0.05),茜草提取物0.1mg/ml+5-Fu 1mg/ml和茜草提取物0.2mg/ml+5-Fu 2μg/ml浓度组内48h与72h之间差异无显著性(P>0.05)。见图5、6。

  2.5  免疫细胞化学法检测药物对胃癌MGC-803细胞株的抗增殖作用  茜草提取物、5-Fu各自作用于胃癌MGC-803细胞株后,PCNA阳性表达率随药物浓度的升高与药物作用时间的延长而降低,除12h时茜草浓度0.2mg/ml与0.4mg/ml之间,12h组5-Fu各浓度之间差异均有显著性外(P<0.05或P<0.01),其余不同浓度与不同作用时间之间差异无显著性。两种药物联合作用时,PCNA阳性表达率低于单独用药组,除12h时茜草0.1mg/ml+5-Fu 1μg/ml与茜草0.2mg/ml+5-Fu 2μg/ml之间差异无显著性外,其余不同浓度与不同作用时间之间差异均有显著性。见图7、8。

  2.6  茜草提取物对胃癌MGC-803细胞中bcl-2蛋白表达的影响  胃癌MGC-803细胞经0.8mg/ml茜草提取物作用48h之后,其bcl-2蛋白阳性表达率明显下降,与对照组(用药诱导凋亡之前的胃癌MGC-803细胞)相比差异有显著性(P<0.01)。见图9。

  3  讨论

  胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前其治疗主要采取外科手术、化疗及放疗等,近年来,中医中药及中西医结合治疗逐渐受到研究者的关注。肿瘤相对无限增生是肿瘤细胞增殖与凋亡的失衡所致[4]。随着对细胞凋亡机制的深入研究,发现大多数抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,诱导凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一[5]。茜草是我国常用中药,经现代医学研究发现茜草含有抗癌成分。为了探讨茜草的抗癌作用及其机制,探讨其与化疗药物联合应用的可能性,本实验进行了茜草提取物联用5-Fu对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡和抗增殖作用研究。

  MTT法常用于肿瘤细胞抗肿瘤药物敏感性检测[6]。本实验结果表明,茜草提取物和5-Fu均能抑制胃癌MGC-803细胞株的生长,两种药物联合作用时,其抑制率明显高于单独用药组。说明两种药物都能抑制肿瘤细胞生长和(或)诱导细胞凋亡。

  为了进一步探明茜草提取物对胃癌MGC-803细胞株的抑制作用,从形态学、生物化学及免疫细胞化学等方法进行了对胃癌细胞的凋亡和抗增殖作用实验。细胞超微结构的改变是确定细胞凋亡发生的最可靠的形态学方法之一[7]。本研究经透射电镜观察发现茜草提取物对胃癌MGC-803细胞凋亡有形态学改变作用。

  肿瘤细胞凋亡的生化学检测用DNA琼脂糖凝胶电泳法和TUNEL法进行。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解DNA产生的“梯形带”与细胞凋亡相联系以来,DNA的“梯形带”一直被作为鉴别细胞凋亡的一个重要的生化标志[8]。本实验结果,0.4μg/ml茜草提取物作用于胃癌MGC-803细胞株24h时和0.4mg/ml茜草提取物+4μg/ml 5-Fu作用24h时均出现DNA电泳“梯形带”。TUNEL法为灵敏度和特异性较高的原位末端标记技术,常用于培养细胞凋亡的检测[9]。本实验结果显示,茜草提取物组、5-Fu组均有细胞凋亡发生,两种药物联合作用时,其APO%明显高于单独用药组。以上形态学和生物化学检测均表明,茜草提取物对胃癌MGC-803细胞株有诱导凋亡作用;与5-Fu联合作用时,其APO%明显提高。

  茜草对胃癌MGC-803细胞株的抗增殖作用检测,有用免疫细胞化学法,用肿瘤细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达进行研究。PCNA的出现和细胞增殖有关,从细胞周期G1期开始增加,S期达高峰。因此,PCNA可以作为细胞增殖的一个指标[10]。本实验结果,对照组胃癌MGC-803细胞的PCNA阳性表达率为92%,表明具有强大增殖潜能;而经不同浓度的茜草提取物、5-Fu、茜草提取物联用5-Fu作用12~72h后,PCNA的阳性表达率均下降,且联合用药组的阳性表达率降低更明显。说明茜草提取物、5-Fu对胃癌MGC-803细胞株有抗增殖作用。

  关于茜草的抗癌作用机制尚不清楚。有报道认为其抗癌机制可能是抑制蛋白质的合成,实验还显示可抑制3H亮氨酸的掺入[11]。本实验进行了茜草提取物对胃癌MGC-803细胞中bcl-2蛋白表达的影响。bcl-2是目前公认的凋亡抑制基因。研究表明bcl-2基因产物并不改变细胞增殖的速度,而是通过抵抗多种形式的细胞死亡,延长细胞寿命,导致细胞数目增加,并能抑制许多抗肿瘤药物诱导细胞凋亡,降低其细胞毒性[12,13]。本实验中,胃癌MGC-803细胞经0.8mg/ml茜草提取物作用48h之后,bcl-2蛋白的阳性表达率明显下降,初步揭示了茜草提取物诱导细胞凋亡的分子生物学机制。

  以上研究结果表明,茜草提取物对胃癌MGC-803细胞株有诱导凋亡和抗增殖作用;茜草提取物与5-Fu联合使用时,其作用明显增强。茜草提取物诱导胃癌MGC-803细胞株凋亡的分子生物学机制可能与下调凋亡抑制基因bcl-2表达有关。
   
  (本文图片见封三)(略)

  【参考文献】

  1   江苏新医学院.中药大辞典(下卷).上海:上海科技出版社,1977,1567.

  2   系川秀治.生药学杂志,1982,36(2):145-149.

  3   方晓艳,孙艳红,杨林莎.茜草的研究进展.河南中医药学刊,2002,17(5):78-80.

  4   戴纪刚,黄小兵,吴廷瑞,等.诱导细胞凋亡:一个有希望的治疗恶性肿瘤的新模式.医学与哲学,1998,8:404.

  5   江石湖,涂水平.羟基喜树碱诱导胃癌细胞凋亡的实验研究.中华消化杂志,1999,19(1):19-21.

  6   张胜本,张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性.成都:四川科学技术出版社,1995,55.

  7   胡野,凌志强,单小云.细胞凋亡的分子医学.北京:军事医学科学出版社,2002,468。

  8   Wyllie AH,Kerr JF,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis.Nature,1980,68:251-306.

  9   彭黎明,王曾礼.细胞凋亡的基础与临床.北京:人民卫生出版社,2000,179-180.

  10  Keim D,Hailat N,Hodge D,et al.Proliferating cell nuclear antigen expression in chidhood acute leukemia.Blood,1990,76(5):985-990.

  11  樊中心.茜草中的抗癌成分.国外医学·中医中药分册,1997,19(4):3-5.

  12  陈亚兵,温龙平.bcl-2基因与细胞编程死亡.国外医学·分子生物学分册,1994,16(4):145-148.

  13  Miyashita T,Reed JC.Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in human leukimia cell line.Blood,1993,81(1):151.

  (编辑:罗  彬)

  作者单位: 133000 吉林延吉,延边大学医学院病理学教研室


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