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产超广谱β内酰胺酶肠杆菌CTX-M-1组的基因型研究

来源:中华实用医药杂志 作者:邵剑春 胡大春 陈爱华 2006-8-20
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摘要: 【摘要】 目的 了解产CTX-M-1型ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在临床的分布情况。 方法 应用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的表型确证试验,筛选出不重复的产ESBLs菌株168株,其中大肠埃希菌148株,肺炎克雷伯菌20株,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测CTX-M-1组基因型。 结果 产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷......


  【摘要】 目的  了解产CTX-M-1型ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在临床的分布情况。 方法  应用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的表型确证试验,筛选出不重复的产ESBLs菌株168株,其中大肠埃希菌148株,肺炎克雷伯菌20株,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测CTX-M-1组基因型。 结果  产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,CTX-M-1型阳性率为分别为53.4%(79/148)和20.0%(4/20)。 结论  产ESBLs的大肠埃希菌多数为CTX-M-1组型,而在产ESBLs肺炎克雷伯菌中不是主要基因型。结果提示有相当一部分引起感染菌株的耐药性是由CTX-M-1组酶引起,并增加了临床抗感染治疗的难度。

  【关键词】  超广谱β-内酰胺酶;CTX-M;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌;聚合酶链反应
    
    超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)又称氧亚氨β-内酰胺酶,是指细菌质粒介导的能水解甲氧亚氨基β-内酰胺类抗生素(oxyimino-β-lactams),如头孢他啶、头孢噻肟以及氨曲南等β-内酰胺酶,由于ESBLs能水解青霉素类、头孢菌素及单环类抗生素,作用底物广泛而称之 [1] 。ESBLs种类最多的是TEM、SHV和CTX-M族。TEM是大肠埃希菌最常见的β-内酰胺酶。SHV是肺炎克雷伯菌最常见的β-内酰胺酶。近年来,一个新的质粒介导的ESBLs家族CTX-M的数量也在不断增加。CTX-M型酶以对头孢他啶、头孢噻肟高水平耐药为主要表型特征。为此,本文对昆明市第一人民医院168株产ESBLs临床分离株进行了CTX-M-1组基因检测,现报告如下。
 
  1 材料与方法

    1.1 菌株来源 2002年1月~2004年6月昆明市第一人民医院细菌室从临床感染病人的痰、尿、血液等标本中分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共435株,筛选出不重复产ES-BLs菌168株,其中大肠埃希菌148株,肺炎克雷伯菌20株。均按照《全国临床检验操作规程》第2版常规培养分离。菌株采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定。

    1.2 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型的初筛与确证 法国梅里埃公司Mueller-Hinton琼脂、英国OXOID生产的药敏纸片,广东乐通泰公司提供。在一个MH平板上同时采用NCCLs推荐的纸片扩散法初筛试验、双纸片确证试验和双纸片协同试验三种方法。用药敏纸片分配器同时贴上初筛试验的头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、头孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、头孢他啶/棒酸(CD02,30μg/10μg/片)和头孢噻肟/棒酸(CD03,30μg/10μg/片),中央贴阿莫西林/棒酸(AMC)。初筛试验、双纸片确证试验结果判读依照NCCLs文件标准。双纸片协同试验的结果判定 [2] :以上CTX、CRO、CAZ、ATM任一纸片与AMC之间出现齿孔状或协同抑菌斑为ESBLs阳性。以双纸片确证试验和协同试验同时阳性确定为ESBLs。以大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、产酶型大肠埃希菌ATCC35218作为质控菌株跟随实验,所有质控结果均在控制范围内。

    1.3 主要仪器 核酸蛋白检测仪:eppendorf公司Biophot-meter型,PCR扩增仪:personal cycler,Biometra型。电泳仪BIO-RAD公司powerPAC3000型。凝胶成像系统:BIO-RAD公司Gel Doc2000型。

    1.4 菌株质粒DNA的提取及PCR扩增

    1.4.1 采用传统碱裂解法提取细菌质粒 [3]  参照文献 [4] 设计引物CTX-M-1组(包括CTX-M-1、3、10、11、12),扩增片段217bp。F:5′-ACAGCGATAACGTGGCGATG-3′R:5′-TCGCCCAATGCTTTACCCAG-3′。

    1.4.2 反应体系 总体积25μl。含10×buffer2.5μl、Mg 2+ 1.5mM2.5μl、dNTPs200uM1.0ul、Taq酶1.0u、Primer50pmol0.5μl、DW14.5μl、DNAtemplate5.0μl,均为上海博亚生物技术有限公司产品。

    1.4.3 PCR扩增 94℃预变性3min,变性94℃45s、退火56℃45s,延伸72℃45s,最后72℃延伸5min。共循环32次。1.4.4 扩增产物的处理 用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,用凝胶成像系统观察结果并照像。每组PCR均设阳性及阴性对照,阴性对照株为大肠埃希菌ATCC25922和蒸馏水。阳性对照株为产酶型大肠埃希菌ATCC35218。

    1.5 数据分析 采用WHONET5.0软件进行分析。产CTX-M-1组型ESBLs检出率的比较用χ 2 检验。

  2 结果

    2.1 产ESBLs株CTX-M-1组基因阳性率 见表1。 表1 产ESBLs株CTX-M-1组基因阳性率菌名 菌株总数 阳性菌株 阳性率(略)注:经χ 2 检验显示,该基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分布差异性有显著性

    2.2 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各种标本中的分布 见表2。产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各类标本的分布有较大差别。大肠埃希菌主要来源于临床送检的尿和痰标本。肺炎克雷伯菌主要来源于痰标本。表2 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各种标本中的分布(略)

    2.3 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各科室的分布特点 产酶菌株广泛分布于多个临床科室,其中分离率最高的科室为ICU和神经外科,分别占16.46%和15.19%,其次为 干疗科占12.66%。见表3。表3 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各科室的分布特点 株(略)
   
  2.4 产CTX-M-1组型ESBLs菌株的耐药状况 见表4。 表4 产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌药敏试验结果(略)

  3 讨论

    早在1986年,日本Matsumoto等在一次动物实验中,从狗的粪便中分离出1株耐头孢噻肟的大肠埃希菌,并发现其产一种非TEM、非SHV的ESBLs,命名为FEC-1。1989年初,德国的Bauernfeind等报道了1株耐头孢噻肟的大肠临床分离株,能产非TEM、非SHV的ESBLs,因其耐头孢噻肟而命名为CTX-M-1 [5] 。之后,CTX-M型ESBLs在世界各地不断被发现,在全球各地区和众多的临床菌种中,特别是肠杆菌科细菌中,形成了一个快速增长的ESBLs家族。至目前CTX-M家族已近40种酶。研究资料显示,CTX-M型ESBLs产酶株的菌谱及地域分布极为广泛,是导致某些地区ESBLs产酶株传播或流行的主要基因型。我国医院感染ESBLs产酶株的分子流行病学研究表明,CTX-M型酶是最为常见的基因型,甚至某些地区CTX-M-1组型ESBLs的检出率已经超过TEM和SHV型ESBLs。国内北京流行CTX-M-14、22、24、SHV-2、12 [6] 。上海以CTX-M-3为主 [7] ,浙江以CTX-M-22、24为主 [8] ,广州发现CTX-M-9、13、14 [9] 。我们的研究结果显示,临床分离菌株中的ESBLs大部分属于CTX-M-1组型,其中CTX-M-1组基因型在产ESBLs大肠埃希菌中阳性率较高,产ESBLs肺炎克雷伯菌中CTX-M-1组基因型是次要的,结果类似于国内一些相关的报道 [10] 。结合CTX-M-1组基因携带率,推测本地大肠埃希菌中的ESBLs可能以CTX-M型为主。昆明以何种CTX-M亚型为主,有待于进一步深入研究。可见,临床感染的大肠埃希菌中有相当一部分分离株的耐药性由CTX-M型酶引起,大大增加了临床抗感染治疗的难度。因此,建议临床医生按照ESBLs的检测结果及NC-CLS指南选择使用抗生素来确定有效的治疗方案。

    CTX-M酶对窄谱头孢菌素水解活性最高,而水解青霉素类的活性不及TEM和SHV。该类酶对头孢噻肟的耐药程度远远高于头孢他啶,通常情况下对头孢噻肟的耐药高于头孢他啶至少35倍 [11] 。对头孢他啶酶活性弱是多数CTX-M酶区别于TEM、SHV头孢菌素酶的标志。此外,CTX-M酶表现出对头孢吡肟、头孢匹罗高度的水解活性,对7-a-甲氧基头孢菌素类(头孢西丁)和碳青酶烯类(亚胺培南、美罗培南)无水解活性。按照欧洲和NCCLS指南,一些产CTX-M酶菌在体外对头孢他啶敏感而在体内耐药。用头孢他啶治疗产CTX-M酶菌引起的感染常会导致治疗失败,并增加CTX-M酶的产生 [12] 。本研究中药敏表型结果显示大肠埃希菌对头孢噻肟的耐药率高达83.8%,而对头孢他啶的耐药率仅为10.1%,这可能是临床大量使用头孢噻肟等抗生素而促成产CTX-M型ESBL耐药株出现的重要原因之一。笔者认为产ESBLs的耐药问题,已成为临床上较为普遍、必须予以高度重视的问题。建议临床医生:(1)临床抗感染治疗中,首先应提高病原微生物送检率,加强ESBLs等耐药细菌的监测;(2)应根据药敏结果,选用合理抗生素,不要盲目进行经验性性治疗;(3)ICU、神经外科等ESBLs发生率较高的病房,可暂停使用β-内酰胺类抗生素,以减少此类抗生素所致的选择性压力,改用β-内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂、头霉素(如头孢替坦)、碳青霉烯类(如亚胺培南)等其它抗生素。 本文结果还显示产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各类标本的分布有较大差别。大肠埃希菌主要来源于临床送检的尿和痰标本,肺炎克雷伯菌主要来源于痰标本。这可能是菌种对不同体液的选择性分布有关。另外,结果还显示:产酶大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌主要分布于ICU、神经科、干疗科、呼吸科等。这些结果与国内报道较接近 [12] 。其可能与科室存在不同程度感染及控制措施的疏漏,由此引起产ESBLs菌株的传播有关。因此,可以认为产酶耐药菌成为优势菌而引起机体的感染,一方面与患者病情危重、机体抵抗力下降、免疫功能低下、接受侵袭性操作(如气管切开、插管等)有关,另一方面与大剂量、长时间广谱抗生素的使用分不开。所以,通过对产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌基因型检测,对查清临床流行状况、预防产ESBLs菌株在临床广泛传播、有效治疗其引起的严重感染性疾病、医院感染控制、指导临床正确合理使用抗生素等多方面具有十分重要意义。
 
  【参考文献】

    1 廖晚珍.哪些菌需检测超广谱β-内酰胺酶有何意义?江西医学检验,2001,19(1):50.

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    12 张阮章,王沙燕,卢月梅,等.产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌blaCTX-M基因的检测.中国微生态学杂志,2004,16(6):342-344.

  * 基金项目:昆明市科技局2002年重点科技计划项目(编号:昆科社字2002-01-18)

    作者单位:650011云南昆明,昆明市第一人民医院

    (编辑:若 木)


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