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抗菌药物诱导性肠球菌耐药的实验研究

来源:INTERNET 作者:刘贵建 许淑珍 2005-8-3
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摘要: 【摘要】 目的 深入研究肠球菌耐药性的产生机制,指导临床合理用药。 方法 采用一步诱导法,对8株粪肠球菌、2株屎肠球菌和9株粪肠球菌、1株屎肠球菌进行四环素和左氧氟沙星诱导性耐药试验。对诱导出的菌株用琼脂稀释法测定药物敏感性。用PCR法检测四环素耐药基因tetM、tetL,用PCR法扩增gyrA、parC基因后测定DNA序列。...


  【摘要】 目的  深入研究肠球菌耐药性的产生机制,指导临床合理用药。 方法  采用一步诱导法,对8株粪肠球菌、2株屎肠球菌和9株粪肠球菌、1株屎肠球菌进行四环素和左氧氟沙星诱导性耐药试验。对诱导出的菌株用琼脂稀释法测定药物敏感性;用PCR法检测四环素耐药基因tetM、tetL,用PCR法扩增gyrA、parC基因后测定DNA序列。 结果  10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的四环素耐药株。耐药株的MIC分别为16~128μg/ml,与原株MIC0.25μg/ml、2μg/ml)比较,增加了16~512倍。在1株实验菌的诱导耐药株的质粒DNA上检测到tetL耐药基因,另一株实验菌株的诱导耐药株的染色体DNA上检测到tetM耐药基因;10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的左氧氟沙星耐药株。诱导耐药株的MIC分别为16~64μg/ml,与原株(MIC2μg/ml、2μg/ml)比较,增加了8~32倍。GyrA的QRDR内的第87位或第83位的氨基酸及ParC的QRDR内的第80位的氨基酸均发生了改变。 结论  一步法抗菌药物诱导性耐药试验的结果表明,肠球菌可在高于耐药MIC浓度的抗菌药物短期作用后获得耐药性。

     【关键词】  肠球菌 抗菌药物 诱导性耐药 抗菌药物压力

       Laboratory study of antibacterial agents on enterococcus induced resistance

     Liu Guijian,Xu Shuzhen

     Microbiology Laboratory,Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University,Beijing100050.
   
     【Abstract】 Objective The purpose of the present research was to study on the emergence mechanism of ente-rococcal resistance to a variety of antibacterial agents,and to guide the selection and use of antimicrobial agents in clinical practice.Methods Eight of faecalis enterococcus and two of faecalis enterococcus,nine of faecalis enterococ-cus and one of faecium enterococcus were selected to performed experiments on induced resistance to tetracycline、lev-ofloxacin respectively by one-step method.The susceptibility of the induced strains resisitant to tetracycline、lev-ofloxacin was measured by determining the MIC using agar dilution method.The tetM and tetL gene in the induced strains were detected by PCR,gyrA and parC gene were amplified by using PCR,then the nucleotide sequence of two genes were analysed.Results Some strains stably resistant to tetracycline were obtained from2of10test strains,the MICs of these laboratory resistant strains were16~128μg/ml.with16-fold~512-fold increase when compared with parental strains(MIC0.25μg/ml、2μg/ml,respectively).The gene of tetL was detected in the plasmid DNA of one test strain and its laboratory resistant strains.The gene of tetMwas detected in the chromosome DNA of the labo-ratory resistant strains from another one test strain.Some strains stably resistant to levofloxacin were obtained from2of10test strains.The MICs of the laboratory stains were16~64μg/ml,with8~32times higher than that of the parental strains(MIC2μg/ml、2μg/ml respectively).Neucleotide sequence analysis and comparison of the derived amino acid sequence revealed that GyrA had a substitution at position83and87in laboratory resistant strains.The alterations in ParC at position80were observed in all laboratory resistant strains.Conclusion The results of in vitro experiments on enterococcal strains for induced resistance to tetracycline and levofloxacin,which were performed by one-step method,show that acquired resistance could be occurred when exposuring them to high level of some antibacterial a-gents for short term.

     【Key words】 enterococcus antibacterial agents induced resistance antibacterial pressure

     近年来,肠球菌作为一种引起医院感染的重要病原菌已经引起了医学界的广泛关注。美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二大病原菌 [1] 。肠球菌不仅具有天然耐药性,而且更易被诱导产生新的耐药性。Tankovic报告对环丙沙星耐药的肠球菌由1987~1989年期间的不到2%增加到1991~1993年间的14%以上,而且是由该类药物在临床上的应用增加所致 [2] 。在瑞典Huddinge医院,对喹诺酮耐药的肠球菌由1994年的11%增加到1997年的25% [3] 。而国内1997~2001年期间临床分离的肠球菌对环丙沙星耐药率分别为粪肠球菌44.2%,屎肠球菌70.7% [4] 。在美国,由于万古霉素的使用,1989~1993年间肠球菌对万古霉素的耐药率增加了20倍。这些统计学临床资料已经显示,抗菌药物的临床应用造成的药物选择性压力可能是引起肠球菌耐药性的产生与扩散的重要原因之一。为深入探索肠球菌耐药性的产生和发展,本课题就此进行了部分抗菌药物的实验研究。

     1 材料与方法

     1.1 材料

     1.1.1 菌株 实验菌株TE1~TE10(TE3、TE9为屎肠球菌,其它为粪肠球菌)用于四环素诱导性耐药试验。实验菌株LE1~LE10(LE2为屎肠球菌,其它为粪肠球菌)用于左氧氟沙星诱导性耐药试验。质控菌株为粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC51299。

     1.1.2 抗菌药物 左氧氟沙星(LEV,5μg/片)、四环素(TCY,30μg/片)药敏纸片购自Oxoid公司。四环素、左氧氟沙星粉剂购自中国生物制品研究所。

     1.1.3 试剂 心脑浸液、M-H琼脂,购自BECTON-DICKINSON公司。Vitek细菌鉴定卡及药敏鉴定卡购自法国生物梅里埃公司。PCR引物由赛百盛公司合成。四环素耐药基因tetM引物为5′-GAC ACG CCA GGA CATATG G-3′,5′-TGC TTT CCT CTT GTT CGA G-3′;四环素耐药基因tetL引物为5′-ATA AATTGTTTC GGG TCG TTA AT-3′,5′-AAC CAG CCA ACT AAT GAC AAT GAT-3′;DNA消旋酶gyrA引物为5′-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3′,5′-AAT TTTACT CAT ACG TGC TTC GG-3′;DNA消旋酶parC引物为5′-AAA CCT GTT CAG CGC CGC AT-3′,5′-TCG GTG TAA CGC ATT GCC GC-3′。

     1.1.4 仪器设备 Vitek AMS-60全自动细菌鉴定及药敏系统(法国生物梅里埃公司)。AG-9600AMPLISENSOR MINILYZER PCR扩增仪(美国)。

     1.2 方法

     1.2.1 实验菌株的选择 依据细菌鉴定及MIC结果,最终选择对四环素敏感的8株粪肠球菌和2株屎肠球菌(MIC0.25~4μg/ml)作为四环素诱导性耐药的实验菌株;对左氧氟沙星敏感的9株粪肠球菌和1株屎肠球菌(MIC0.5~2μg/ml)作为左氧氟沙星诱导性耐药实验菌株。

     1.2.2 药物敏感性试验 琼脂稀释法参照2002年NCCLS推荐的方法进行操作及判读结果,同时测定粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC51299的MIC进行质控。

     1.2.3 四环素诱导性耐药试验 采用一步法。参照文献 [5] 及肠球菌对四环素耐药的MIC界值,首先确定四环素诱导耐药试验的药物浓度为20μg/ml、细菌接种量为10 7 CFU/每个平板。将实验菌制备成1×10 8 CFU/ml菌悬液,取100μl菌悬液加入到含20μg/ml四环素的BHI琼脂平板上,用无菌L形棒均匀涂布平板,35℃培养24h、48h、72h、96h、120h后观察结果,并记录生长的菌落数。取培养后生 长出的菌落,纯培养后制备1×10 8 CFU/ml菌悬液,取100μl菌悬液涂布接种新鲜制备的含20μg/ml四环素的BHI琼脂平板,35℃培养18~24h,观察有无细菌生长。在新鲜制备的及35℃分别放置了24、48、72、96和120h的含20μg/ml四环素的BHI琼脂平板上,涂布接种100μl1×108CFU/ml粪肠球菌ATCC29212及实验菌悬液,于35℃培养18~24h后观察有无菌落生长。对诱导出的菌株用琼脂稀释法测定药物敏感性,用PCR检测tetL和tetM耐药基因。

     1.2.4 左氧氟沙星诱导性耐药试验 采用一步法。参照四环素诱导性耐药试验,首先确定左氧氟沙星诱导耐药试验的药物浓度为10μg/ml。其余步骤基本同四环素诱导性耐药试验。此外,对部分诱导出的菌株的gyrA和parC基因扩增后,进行DNA序列分析。

     1.2.5 诱导性耐药菌株的稳定性试验 将诱导的耐药菌接种在无抗菌药物BHI肉汤中,35℃培养,每24h转种一次,连续培养10代。然后进行药物敏感性测定。

     1.2.6 耐药基因测定 碱裂解法制备质粒DNA、参照方法 [6] 制备染色体DNA。PCR反应体系100μl,含模板DNA约0.2μg,引物0.2μmol/L,0.2mmol/L dNTP,10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,2.5mmol/L MgCl 2 ,2.5U TaqDNA聚合酶。耐药基因DNA测序:将gyrA、parC和部分实验菌株的tetL基因扩增产物经DNA纯化后送北京华大中生科技发展有限公司测序部进行DNA序列测定。测序结果对照基因库检索结果进行分析。

     2 结果

     2.1 四环素诱导性耐药试验结果

     2.1.1 诱导性耐药培养结果 (1)实验菌TE5和TE8在48h~120h培养过程中分别生长了131、87个菌落。TE1~TE4、TE6~TE7、TE9~TE10实验菌株在120h培养过程中,无菌落生长。(2)将48~120h生长的菌落再次以相同的菌量分别接种含四环素BHI琼脂平板,24h培养后菌落融合生长成菌膜。(3)在35℃已经放置了24~120h的含四环素BHI琼脂平板上,分别接种了TE5、TE8和ATCC29212,24h培养后无肉眼可见的菌落生长。

     2.1.2 诱导性耐药菌株的药物敏感性 随机选择的48h和72h生长出的诱导菌株全部为四环素单耐药株,与原株相比,TE5、TE8诱导株的MIC分别增加了64~512和16~64倍。药敏结果详见表1。将诱导的耐药菌株在BHI肉汤中进行连续10天的传代培养后测定MIC,结果与传代前比较无明显改变。

     表1 四环素诱导的菌株的耐药性(略)注:TE521、TE522、TE821、TE822分别为实验菌株TE5和TE8的48h诱导耐药株;TE531、TE831、TE532、TE832分别为实验菌株TE5和TE8的72h诱导耐药株。

     2.1.3 诱导性耐药菌株耐药基因的检测 对原株、耐药菌株TE521,TE821;TE531,TE831;TE532,TE832,经PCR扩增检测四环素耐药决定子tetL、tetM。结果在TE5及诱导耐药株的质粒DNA上检测到tetL,在TE8诱导耐药株的染色体DNA上检测到tetM。对TE5、TE521的tetL基因进行了测序,其结果与Genbank中的序列同源性为99%,TE5与TE521的序列完全一致。

     2.2 左氧氟沙星诱导耐药性试验结果

     2.2.1 诱导性耐药培养结果 (1)实验菌株LE1,LE5在48h~120h培养过程中分别生长了54、48个菌落。LE2~LE4、LE6~LE10实验菌株在120h培养过程中,无菌落生长。(2)48~120h生长的菌落再次以相同的菌量接种含左氧氟沙星BHI琼脂平板,24h培养后生长成菌膜。(3)在35℃已经放置了24~120h的含左氧氟沙星BHI琼脂平板上,分别接种了1×10 7 CFU/平板的LE1、LE5和ATCC29212,在24h培养后无肉眼可见的菌落生长。

     2.2.2 诱导性耐药菌株的耐药性 诱导获得的耐药菌株全部为左氧氟沙星单耐药菌株,与原株相比,LE1、LE5诱导耐药株的MIC分别增加了16~32倍和16倍。将诱导的耐药菌株在BHI肉汤中进行连续10天的传代培养后测定MIC,结果与传代前比较无明显改变。结果详见表2。表2 左氧氟沙星诱导的菌株的耐药性(略)注:LE121、LE131、LE141分别为实验菌株LE1在48h、72h和96h诱导培养后生长的菌株;LE521、LE531、LE541分别为实验菌株LE5在48h、72h和96h诱导培养后生长的菌株。

     2.2.3 诱导性耐药菌株的耐药基因检测 对原株、耐药菌株LE121,LE521;LE131,LE531;LE141,LE541和标准菌株ATCC51299、ATCC29212,分别经PCR扩增gyrA和garC。结果全部菌株均在扩增产物的电泳图谱上出现了241bp的gyrA和248bp的parC条带。gyrA经测定DNA序列,LE121的喹诺酮耐药决定区(QRDR)内的第87位的谷氨酸(密码子GAA)置换为赖氨酸(密码子AAA)。LE131QRDR内的第83位的丝氨酸(密码子AGT)置换为异亮氨酸(密码子 ATT)。LE141QRDR内的第83位的丝氨酸(密码子AGT)置换为精氨酸(密码子AGA)。LE521、LE531、LE541QRDR内的第87位的谷氨酸(密码子GAA)均置换为赖氨酸(密码子AAA)。parC经测定DNA序列,LE1和LE5的诱导耐药株与原株比较,parC编码的蛋白质QRDR内的第80位的丝氨酸(密码子AGT)均置换为异亮氨酸(密码子ATT)。结果详见表3、表4。

     表3 左氧氟沙星诱导的耐药菌株的gyrA序列改变(略)

     表4 左氧氟沙星诱导的耐药菌株的parC序列改变(略)
   
     3 讨论

     在一步法抗菌药物诱导性耐药试验中,分别接种了1×10 7 CFU实验菌于含高于耐药MIC浓度的左氧氟沙星BHI琼脂平板和四环素BHI琼脂平板上,实验菌株在24h培养后均无肉眼可见的菌落生长,表明肠球菌对左氧氟沙星和四环素耐药菌株的自发突变率一般低于1×10 -7 。48h后诱导生长的菌株再次接种含抗菌药物BHI琼脂平板,则于24h培养后生长成菌膜,表明为非缓慢生长的肠球菌。实验菌株和ATCC29212接种在35℃已预先放置了24~120h的含抗菌药物BHI琼脂平板上,培养24h后无菌落生长,示诱导生长的菌株不是因为培养基中的抗菌药物活性下降所致。药物敏感性测定结果表明诱导后生长的菌株均单独对左氧氟沙星或四环素耐药。以上结果表明分别在含左氧氟沙星或四环素的BHI琼脂平板上,于48h后生长的菌株均应为药物诱导产生的耐药菌株。

     肠球菌对喹诺酮类药物耐药的主要机制是由于DNA促旋酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶Ⅳ(parC)基因突变引起。一般认为parC为肠球菌对喹诺酮类药物耐药的第一突变基因,低中水平耐药一般仅有parC突变,高水平耐药常既有parC突变,又有gyrA的突变,尚未发现仅有gyrA突变而无parC突变的肠球菌耐药菌株。本实验中诱导的耐药株未见gyrA编码的蛋白质QRDR内的第83和87位氨基酸,或parC编码的蛋白质QRDR内的第80和84位氨基酸同时发生改变的诱导耐药株。此结果与文献报道类似 [7] 。肠球菌对四环素的主要耐药机制为产生外排蛋白和核糖体保护因子,其中最主要、最常见的2种耐药决定子为tetL、tetM。本实验诱导的四环素耐药株的PCR扩增结果显示,TE8实验株的诱导耐药株全部含有tetM耐药决定子,而未检测到tetL耐药确定子。TE5实验株及其诱导耐药株全部检测到tetL,而未检测到tetM。TE5实验株为四环素敏感菌株,其MIC为0.25μg/ml,但在其质粒中检测到tetL耐药决定子,此种基因型和耐药表型不一致的现象尚未见报道。推测可能为某种因素抑制了tetL的表达,经四环素作用后, 解除了对tetL表达的抑制,进而对四环素产生耐药。

     本研究中对诱导的耐药菌株耐药基因的检测结果表明,实验诱导的耐药菌株的基因型与临床分离的肠球菌基本一致,这不仅从分子水平进一步证明了本研究中抗菌药物作用下生长的菌落为耐药菌株,而且从某种程度上显示临床耐药菌株的产生和扩散与抗菌药物的使用确实密切相关。已有的大量文献表明临床上广泛应用和滥用抗菌药物是引起细菌耐药性产生和发展的主要原因之一。本研究通过体外实验证实了肠球菌可在高浓度的抗菌药物作用后获得耐药性。因此在临床抗感染治疗中应该合理使用抗菌药物。

  参考文献

  1 Schaberg DR,Culver DH,Gaynes RP.Major trends in the microbial eti-ology of nosocomial infections.Am J Med,1991,91:72-75.

  2 Tankovic J,Mahjoubi F,Courvalin P,et al.Development of fluoro-quinolone resistance in enterococcus faecalis and role of mutations in the DNA gyrAse gyrA gene.Antimicrob Agents Chemother,1996,40:2558-2561.

     3 Amin EL,Jalal S,Wretlind B.Alterations in gyrA and parC associated with fluoroquinolones resistance in enterococcus faecium.Antimicrob A-gents Chemother,1999,43:947-949.

     4 刘贵建,许淑珍,李景云,等.北京地区和其他地区临床分离的肠球菌耐药性比较分析.中华医学杂志,2003,83:1049-1052.

  5 Alonso A,Campanario E,Martinez JL.Emergence of mutidrug-resistent mutants is increased under antibiotic selective ressure in Pseudomonas aeruginosa.J Microbiol,1999,145:2857-2862.

  6 林万明.PCR技术操作和应用指南,北京:人民军医出版社,1995,31-32.

  7 Kanematsu E,Deguchi T,Yasuda M,et al.Alterations in the gyrA sub-unit of DNA gyrAse and the parC subunit of DNA topoisomeraseⅣin enterococcus faecalis.Antimicrob Agents Chemother,1998,42:433-435.
 
  基金项目:北京市自然科学基金资助项目(编号:7012013)

  作者单位:100050首都医科大学附属北京友谊医院检验


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