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携带Tip30和人IFN-γ基因的鼠减毒沙门菌的制备

来源:中华实用医药杂志 作者:江中明曹志中吕春堂赵平高军 2005-8-3
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摘要: 【摘要】 目的 构建含有HIV tip30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的减毒伤寒沙门菌,以进一步观察以减毒伤寒沙门菌为载体的,联合HIV tip30与IFN-γ的基因对腺样囊性癌的治疗作用。方法 以PCR扩增HIV tip30和人IFN-γ基因,分别插入真核表达载体pCI-neo,构建成重组表达质粒pCI-tip30和pCI-IFN,再构建HIV tip30与人......


  【摘要】 目的 构建含有HIV tip30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的减毒伤寒沙门菌,以进一步观察以减毒伤寒沙门菌为载体的,联合HIV tip30与IFN-γ的基因对腺样囊性癌的治疗作用。方法 以PCR扩增HIV tip30和人IFN-γ基因,分别插入真核表达载体pCI-neo,构建成重组表达质粒pCI-tip30和pCI-IFN,再构建HIV tip30与人IFN-γ基因的共表达质粒pCI-tip30/IFN。分别将重组表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到口服携带基因的减毒伤寒沙门菌,体外转染小鼠NIH3T3细胞株,用免疫印迹和ELISA对表达产物进行鉴定。结果 免疫印迹试验表明携带质粒pCI-tip30和pCI-tip30/IFN的减毒伤寒沙门菌转染的小鼠NIH3T3细胞能表达tip30蛋白,ELISA检测则显示携带质粒pCI-IFN和pCI-tip30/IFN的减毒伤寒沙门菌转染的小鼠NIH3T3细胞能分泌性表达人IFN-γ。结论 成功研制了分别含有真核表达质粒pCI-tip30、pCI-IFN、pCI-tip30/IFN的口服减毒伤寒沙门菌,为下一步以减毒伤寒沙门菌为载体,联合HIV tip30与人IFN-γ基因治疗腺样囊性癌的研究奠定了基础。
     
  关键词 Tip30 干扰素-γ 减毒伤寒沙门菌 基因治疗
    
  Development of a recombinant attenuated Salmonella typhimurium 

  harboring Tip30and human IFN-γgenes  

  Jiang Zhongming,Cao Zhizhong,L Chuntang,et al.

    Department of Stomatology,The Second Military Medical University,Shanghai200433.
     
  【Abstract】 Objective To develop a recombinant attenuated Salmonella typhimurium harboring an eukaryotic co-expression plasmid encoding Tip30and human IFN-γgene for further study of gene therapy on adenoid cystic carcinoma.Methods The tip30and human IFN-γgene were amplified by PCR and inserted into eukaryotic expresˉsion vector pCI-neo for the construction of expression plasmids pCI-tip30and pCI-IFN,respectively.A co-exˉpression plasmid pCI-tip30/IFN was constructed by linking HIV tip30and human IFN-γgene using the sequence of internal ribosome binding sequence(IRES).Three recombinant expression plasmids were transformed into an attenuˉated AroA - autotrophic mutant of Salmonella typhimurium SL7207respectively to get the three oral recombinant attenˉuated Salmonella typhimuriums,the resultant bacteria was used to transfected to mouse NIH3T3cell in vitro and the expressed products were detected by Western blot and ELISA,respectively.Results Mouse NIH3T3cell transfected with recombinant Salmonella transformed
 with both plasmids pCI-tip30and pCI-tip30/IFN could express tip30proˉtein,and mouse NIH3T3cell transfected with recombinant Salmonella transformed with pCI-IFN or pCI-tip30/IFN could secret human IFN-γin the culture supernatant.Conclusion The oral recombinant attenuated Salmonella tyˉphimurium harboring plasmid pCI-tip30′IFN,co-expressing HIV Tip30and human IFN-r was successfully develˉoped,which provide an experimental basis for the research of gene therapy combining tip30and human IFN-γon adenoid cystic carcinoma using live attenuated Salmonella vector.
     
  Key words Tip30 interferon-γ attenuated Salmonella typhimurium gene therapy  

  TIP30是因能增强Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)转录调节蛋白Tat的转录而被新发现的一种抑癌基因,与人类肿瘤转移抑制基因CC3同源,能上调一系列与细胞凋亡有关的分子的表达及血管生成抑制基因的表达,同时下调血管生成刺激因子的表达,从而抑制肿瘤生长和转移,在肿瘤基因防治中有潜在的应用前景 [1~3]  。

    IFN-γ主要由T细胞和NK细胞分泌的多功能细胞因子,对肿瘤细胞有直接抑制DNA合成和细胞分裂的作用,  还能通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢正常细胞向肿瘤细胞的转化过程。此外,还能激活巨噬细胞、NK细胞等直接杀伤肿瘤细胞。目前临床已广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗 [4,5]  。在口腔颌面部应用舌癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、牙龈癌的研究和应用,取得了良好的效果 [6,7]  。

    本研究构建了TIP30与人IFN-γ共表达质粒,转化到减毒伤寒沙门菌,得到携带基因的口服减毒伤寒沙门菌,在体外检测、分析了其转染性和作为基因防治载体的可行性,为进一步观察其体内抗腺样囊性癌作用奠定了基础。

  1 材料和方法

    1.1 材料 克隆有HIV tip30基因的质粒pcDNA-tip30由美国Nebraca大学肖华教授馈赠;克隆有人IFN-γ的质粒pSK-IFN-γ由本校基础部赵平讲师馈赠;编码脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)序列的质粒pIRES-neo为Clontech产品;pMD18-T载体为TaKaRa产品;真核表达质粒载体pCI-neo为Promega产品;鼠伤寒沙门菌LB5000和减毒鼠伤寒沙门菌SL7207为美国Stanford大学Bruce Stocker教授馈赠;小鼠成纤维(NIH3T3)细胞由本院中心实验室冻存;抗tip30单克隆抗体由美国Nebraca大学肖华教授惠赠;HRP标记的山羊抗小鼠IgG为Sigma产品;人IFN-γELISA试剂购于深圳晶美生物工程有限公司。

    1.2 人IFN-γ真核表达质粒的构建 根据人IFN-γ的cDNA序列(包括信号肽)设计、合成引物,上游引物:5′-GCGGCCGCGTCGACACCATGAAATATACAAGTTATATCTTGG-3′,引入Not I和Sal I酶切位点,下游引物:5′-GCGGCˉCGCTTACTGGGATGCTCTTCGACC-3′,引入Not I酶切位点。以含有人IFN-γ基因的质粒pSK-IFN-γ为模板,PCR扩增IFN-γcDNA,引物浓度0.1mM,dNTP浓度0.2mM,退火温度60℃,72℃延伸1min10sec,30个循环,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收,再与pMD18-T载体连接,得到的重组质粒pMD18-IFN以Not I酶切,切出的IFN-γ基因
与经Not I酶切线性化并用碱性磷酸酶去磷酸化处理的pCI-neo连接,得到的重组质粒以Sal I酶切,鉴定出IFN-γ基因正向插入的重组质粒pCI-IFN。

    1.3 tip30真核表达质粒的构建 根据Tip30的cDNA序列设计、合成引物,上游引物:5′-GCTAGCACCATGGCˉCGAAACAGAAGCC-3′,下游引物:5′-GAATTCTCATGˉGCTTGAGAGAGCCATG-3′。上、下游引物中分别引入NheI,Eco RI酶切位点。以质粒pcDNA-Tip30为模板,PCR扩增Tip30基因,引物浓度0.1mM,dNTP浓度0.2mM,退火温度60℃,72℃延伸1min10sec,30个循环,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收,再与pMD18-T载体连接,得到的重组质粒pMD18-Tip30以NheI、Eco RI酶切出Tip30基因,插入pCI-neo的NheI、EcoRI酶切位点之间,得到重组表
达质粒pCI-Tip30。

    1.4 tip30与人IFN-γ共表达质粒的构建 质粒pCI-IFN、pCI-IFN以NheI、EcoRI酶切后,与经NheI、EcoRI酶切的tip30基因连接,得到质粒pCI-tip30-IFN。以EcoRI、 SmaI酶切质粒pIRES-neo,切出的IRES基因插入用相同酶切的质粒pCI-tip30-IFN,即得到编码tip30与人IFN-γ的质粒pCI-tip30-IRES-IFN,简称为pCI-tip30/IFN。

    1.5 构建表达质粒的口服减毒伤寒沙门菌 [8]   将质粒pCI-IFN、pCI-tip30、pCI-tip30/IFN和空载体pCI-neo分别转化氯化钙处理的鼠沙门菌LB5000,提取质粒,用Gene Pulser ○ R (Bio Rad)电穿孔仪转化经10%甘油处理的减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,分别得到携带基因的重组减毒伤寒沙门菌SL7207/pCI-IFN、SL7207/pCI-tip30、SL7207/pCI-tip30/IFN和SL7207/pCI-neo。

    1.6 携带基因的减毒伤寒沙门菌转染小鼠NIH3T3细胞 小鼠NIH3T3细胞株接种于60mm细胞培养皿,80%融合以后,以PBS洗4遍,再分别加重组沙门菌SL7207/pCI-IFN、SL7207/pCI-tip30、SL7207/pCI-tip30/IFN和SL7207/pCI-neo(10 5 个细菌),室温放置1h后以含50μg/ml庆大霉素的DMEM洗2遍,加同样培养基培养放置于37℃5%CO 2 细胞培养箱培养4h,改为以含50μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的DMEM培养,48h后检测目的蛋白表达。

    1.7 小鼠NIH3T3细胞表达产物的检测 收集细胞培养上清,再将细胞培养皿置于冰上,加200μl细胞裂解,20min后将细胞裂解液转移至1.5ml离心管。细丙培养上清用ELISA检测人IFN-γ,每一培养上清作3复孔。细胞裂解液进行SDS-PAGE和western-blot检测tip30的表达,一抗为1∶200稀释的抗tip30单克隆抗体,二抗为1∶500稀释的IRP标记的山羊抗小鼠IgG,抗体稀释液为含12%山羊血清和0.5%Tween20的PBS(pH7.4)。

  2 结果

    2.1 重组表达质粒的结构 构建的表达质粒的转录调控区结构如图1(P为CMV启动子和增强子序列,IRES为脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点序列,SVpA为SV40转录终止polyA序列)。

    2.2 小鼠NIH3T3细胞表达tip30的western-blot分析 小鼠NIH3T3细胞的western-blot检测表明,SL7207/pCI-tip30、SL7207/pCI-tip30/IFN转染的NIH3T3细胞均能表达tip30,分子量与预期30kD相符合,而SL7207/pCI-neo转染的NIH3T3细胞裂解液中未检测出该蛋白条带(见图2)。

  图1 重组表达质粒的结构略

    图2 Western-blot检测TIP30的表达略
    
  A:转化减毒沙门菌SL7207/pCI-neo转染小鼠NIH3T3细胞;B:转化减毒沙门菌SL7207/pCI-tip30转染小鼠NIH3T3细胞;C:转化减毒沙门菌SL7207/pCI-tip30/IFN转染小鼠NIH3T3细胞

  2.3 小鼠NIH3T3细胞分泌表达人IFN-γ的ELISA检测 在酶标仪450nm波长吸收值,细胞培养上清的ELISA检测表明,SL7207/pCI-IFN和SL7207/pCI-tip30/IFN转染的NIH3T3细胞均能分泌性表达人IFN-γ(见表1)。
   
  表1 ELISA检测细胞培养上清中的人IFN-γ (略)

    3 讨论

  涎腺腺样囊性癌是发病率位居第2位的涎腺恶性肿瘤,具有浸润生长特性,早期远处转移率高,预后较差,对放疗、化疗不敏感,目前尚无理想的预防和治疗方法。基因预防和治疗是目前已被公认为防治恶性肿瘤最有潜力的方法之一,为那些手术后仍旧发展为进展期和转移癌的患者防治来带了新的策略。

    联合基因防治是基因防治的一个发展方向,目前研究较多的是不同目的基因之间的联合应用,寻找更佳的肿瘤治疗模式。鉴于临床IFN-γ涎腺腺样囊性癌的疗效及TIP30的分子功能,对本研究联合TIP30与IFN-γ进行基因预防和治疗,从不同方式诱导、促使肿瘤细胞凋亡/死亡,它们之间可能有协同作用,优于单基因对肿瘤的预防和治疗。本研究利用pCI-neo为载体,构建了pCI-tip30、pCI-IFN,并在同一转录盒中引入脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建成功共编码TIP30和人IFN-γ的质粒pCI-tip30/IFN。

    鼠减毒伤寒沙门菌是一种良好的口服型基因载体 [9,10]  。减毒伤寒沙门菌可以通过肠道粘膜侵入体内,并选择性感染、定植于肿瘤组织,是肿瘤靶向基因防治的新的理想载体 [9,11]  。本研究使用的鼠减毒伤寒沙门菌SL7207为编码分支酸合成酶的aroA基因缺陷,不能合成分支酸。

    沙门菌利用分支酸合成对羟基苯甲酸(pAB)和2,3-二羟 基苯(DHB),由于pAB和DHB都不是哺乳动物细胞的代谢产物,所以aroA基因缺陷的沙门菌不能在哺乳动物细胞内增殖 [12]  。以这种减毒沙门菌为质粒的载体,在侵入肿瘤细胞以后,沙门菌本身因营养缺陷而死亡,随着菌体的溃解,质粒DNA被释放到肿瘤细胞的胞浆并被转移至细胞核,表达抗原蛋白。体外以重组表达质粒转化的减毒沙门菌SL7207转染小鼠NIH3T3细胞后发现,小鼠NIH3T3细胞能表达TIP30和人IFN-γ。表明沙门菌能输送重组质粒到细胞内表达其编码的目的基因,作为基因防治的载体具有可行性。本研究将进一步以口服给药途径将这些携带基因的重组伤寒沙门菌接种荷瘤裸鼠模型,观察其对涎腺腺样囊性癌防治作用。

  参考文献

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  基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号30171055)

  作者单位:1 200433上海第二军医大学长海医院口腔科
  
       2 200433上海第二军医大学微生物教研室

  (收稿日期:2004-07-27)

  (编辑罗 彬)


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