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β-内酰胺类抗生素耐药机制研究进展

来源:中华实用医药杂志 作者:张慧芳 林赴田 2005-8-3
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摘要: 细菌耐药性的发生和发展是抗生素广泛应用,特别是无指征滥用的结果 [1] 。加强耐药菌监测、限制抗生素的滥用、阻止耐药传播、进一步深入研究细菌的耐药机制和从预防耐药性角度出发,不断研制和开发新的抗生素和非抗生素类抗菌药物,将成为今后的工作重点。本文就细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制做一综述。 β-......


  细菌耐药性的发生和发展是抗生素广泛应用,特别是无指征滥用的结果 [1] 。加强耐药菌监测、限制抗生素的滥用、阻止耐药传播、进一步深入研究细菌的耐药机制和从预防耐药性角度出发,不断研制和开发新的抗生素和非抗生素类抗菌药物,将成为今后的工作重点。本文就细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制做一综述。
   
  β-内酰胺类抗生素对各种细菌的耐药机制因革兰阳性菌和阴性菌的不同而有一定的差别,大体上可以分为4种:(1)被细菌产生的β-内酰胺酶分解而失活;(2)与细菌结合的作用靶位PBPs改变而引起亲和性改变;(3)细菌细胞膜通透性和(或)其它特性发生改变而引起菌体内药物摄取量的减少;(4)被细菌主动泵出机制排出细胞外。其中(1)和(2)的作用方式专一性很强,即细菌仅对某种或某一类抗生素产生耐药性,而(3)和(4)则是非专一的作用方式,即具有这2种耐药机制的细菌对不同结构类别或不同作用机制的抗菌药物都能产生耐药性 [2] 。

  1 细菌产生β-内酰胺酶
    
  β-内酰胺酶是由细菌产生的酶类,通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β-内酰胺环,导致β-内酰胺类抗生素失活,这是大多数致病菌对β-内酰胺类抗生素耐药性的主要机制 [3] 。
   
  β-内酰胺酶种类很多,特性各异,具有不同特性的β-内酰胺酶的细菌对不同结构的β-内酰胺类抗生素的耐受性不同。目前公认的分类方法有2种,一种是1990年Ambler根据酶分子结构的不同将酶分为A、B、C、D4类:A类为丝氨酸蛋白酶,B类为金属β-内酰胺酶,C类为头孢菌素酶,D类为苯唑西林水解酶;另一种是1995年Bush [4] 根据分子量、等电点、被抑制谱、对底物的水解谱等将其分为4组:第1组为不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶,第2组为常能被活性位点诱导的抑制剂抑制的β-内酰胺酶;第3组为不被所有β-内酰胺酶抑制剂(乙二胺四乙酸和对氯苯甲酸泵除外)抑制的金属β-内酰胺酶;第4组为不被克拉维酸抑制的青霉素酶(见表1)。其中,重要的有AmpC型β-内酰胺酶和超广谱酶(ESBLs)。
    
  表1 β-内酰胺酶的分类(略)
   
  1.1 AmpC型β-内酰胺酶 AmpC型β-内酰胺酶最初是在耐氨苄西林的大肠埃希菌中发现的,由染色体编码,根据其耐药性而命名,近年也不断分离出由质粒介导的与其同源的头孢菌素酶,使它的概念有了很大的拓展,表示由革兰阴性菌产生的不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶组成的一个酶家族,统称为AmpC族酶,分为染色体介导的AmpC型和质粒介导的AmpC型β-内酰胺酶。
   
  1.1.1 染色体介导的AmpC酶 染色体介导的AmpC酶分为诱导型和非诱导型2种,表达受amp复合操纵子的调控,amp操纵子由4个不连锁的基因组成:ampC、ampR、ampD和ampG [5] ,其中ampC为结构基因,ampR(调节基因产物)、am-pD(阻遏物)、ampG(透性酶)参与基因调控。通常AmpC酶在野生菌株中仅低水平表达,而在相应的抗生素和其他刺激诱导下呈高水平表达,其分子机制为无诱导物存在时,产物ampR与ampC结合,阻止ampC转录,菌株不产生AmpC酶;当ampD基因突变,不能表达相应功能的ampD,失去对ampR的阻遏作用,引起AmpC酶的高表达。另外一种Am-pC诱导的辅因子是细胞壁前体物质胞壁肽的脱水形式,有2种可能的胞壁肽是:N-乙酰胞壁酸三肽和五肽,这些辅因子结合到AmpR上,限制了AmpR作为一种激活剂的作用。这可能是AmpC诱导产生的一般机制。具体的诱导过程是:由于β-内酰胺类抗生素抑制了细胞壁的合成,从而导致前体物质1,6-脱水-N-乙酰胞壁肽在胞质内的积聚;这些前体物质通过AmpG被运送进入胞浆,在这里被一种胞浆酶转化成1,6-脱水胞壁肽,这种物质将转录调节因子AmpR转化为AmpC表达的活化因子,从而启动AmpC酶表达。染色体介导的AmpC酶常见于肠杆菌属、枸橼酸菌属、沙雷菌属、假单胞菌属 [68] 。约40%肠杆菌属、沙雷菌属、枸橼酸菌属等可高产AmpC酶。头孢西丁、克拉维酸为其强诱导剂,对第三代头孢菌素、头霉素类及β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合物均耐药,对氯唑西林敏感。
   
  1.1.2 质粒介导的AmpC酶 近年来,AmpC型β-内酰胺酶出现了由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移的趋势,其机制尚不清楚,但大大提高了AmpC型β-内酰胺酶的传播能力。质粒介导的AmpC酶与染色体编码的Am-pC酶在分子结构上具有一定的同源性(37%~99%),因为没有调控基因,呈持续高表达,且由于质粒的快速复制和可转移性,极易在菌株以及不同菌属间传播,造成更多菌株耐药。目前报道的此类酶有25种 [9] ,据其遗传学特征分为5个家族:阴沟肠杆菌起源的Entb族(MIR-1、ACT-1);枸橼酸菌起源的LAT族(LAT-1,2,3,4、CMY-2,3,4,5,6,7,9和BIL-1);摩氏摩根菌起源的Morg族(DHA-1);蜂房哈夫尼起源的haf族(ACC-1);未知起源的FOX族(FOX-1,2,3,4,5,6;CMY-1;MOXl,2和CMY-8)。质粒介导的Am-pC酶常见于大肠埃希菌、克雷伯菌、产气肠杆菌、沙门菌属等,对第三代头孢菌素,头霉素、氨基糖苷类等均耐药,而对碳青霉烯类、第四代头孢菌素、氟喹诺酮类敏感。
   
  1.2 ESBLs ESBLs是一类水解窄谱青霉素、头孢菌素及肟类头孢菌素、单环内酰胺菌素的β-内酰胺酶,一般对头霉素、酶抑制剂复合物、碳青霉烯类抗生素敏感。现已发现90余种TEM型ESBLs,30余种SHV型ESBLs;尚有非TEM及非SHV型的ESBLs:CTX系列酶12种、PER-1、PER-2及OXA系列酶25种 [1011] 。ESBLs通常由质粒编码,易在肠杆菌科间传播,可将耐药质粒以转化、传导、整合、易位、转座等方式传播给其它细菌,从而导致多种细菌都产生耐药性。ESBLs主要由克雷伯菌属及大肠埃希菌、变形杆菌属、普罗菲登菌属、肠杆菌属等细菌产生,作用于大多数青霉素、第一、二、三代头孢菌素和单环类;而第四代头孢菌素、碳青霉烯类不受该酶作用;并可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。
   
  1.2.1 TEM及SHV型ESBLs 编码TEM和SHV型ESBLs的基因由TEM-1、TEM-2和SHV-1的结构基因突变进化而来。此型ESBLs能水解第三代头孢、单环β-内酰胺类,其活性能被克拉维酸、舒巴坦等酶抑制剂所抑制,对氨基糖苷类、氟喹诺酮类等抗菌药物,携带ESBLs的基因常同时携带氨基糖苷类、氟喹诺酮类、氯霉素等的耐药基因,从而引起多重耐药。
   
  1.2.2 非TEM及SHV型ESBLs 包括CTX-M-1至CTX-M-10、Toho-1和Toho-2、RER-1、RER-2、OXA型ES-BLs等。CTX-M、Toho-1,2型ESBLs的特点为:能高度水解头孢噻肟,耐氨曲南,而对头孢他定、亚胺培南等的敏感性不受影响 [12] 。PER-1、PER-2对第三代头孢、氨曲南高度耐药,能高度水解对多数ESBLs稳定的头孢布烯类。OXA型ESBLs常见于铜绿假单胞菌,能高度水解苯唑西林、甲氧西林、氯唑西林,不能被克拉维酸等酶抑制剂所抑制,对头孢菌素类抗生素的水解活性低于对青霉素类的活性 [13] ,对头霉素、亚胺培南等稳定。
   
  现已发现产可诱导AmpC酶的菌株同时可产ESBLs。有学者将细菌同时产生的ESBLs和质粒型AmpC酶称为超超广谱β-内酰胺酶(SSBLs)。该类菌株的耐药性更强,传播更广,控制临床相应感染更困难。

  2 作用靶位PBPs的改变
    
  β-内酰胺类抗生素与细菌内膜结合的专一靶位为青霉素结合蛋白(penicilinbindingprotein,PBP),由于这些靶位能与同位素标记的青霉素共价结合而得名。PBPs具有酶活性,在细菌生长繁殖过程中起重要作用,参与肽聚糖的合成。高分子量PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3为细菌生长所必需,PBP1a、PBP1b为转肽酶和转糖苷酶,催化多聚糖链延伸及肽聚糖交联。PBP2、PBP3为转肽酶,PBP2启动新生肽聚糖插入延伸位点,PBP3特异作用于横隔形成;低分子量PBP4、PBP5、PBP6ab、PBP6b及PBP7为非细菌生长所必需,多为D-羧肽酶,能使五肽侧链末端D-丙氨酸水解生成四肽 [14] 。
   
  PBPs的改变包括:(1)PBPs数量改变或缺失;(2)药物与PBPs亲合力下降;(3)细菌产生缓慢结合的PBPs;(4)诱导性PBPs的出现。这种耐药性不依赖β-内酰胺酶,广泛存在于人类病原菌中。由PBPs介导的耐药性在G + 菌比G - 菌中更常见和重要,其中最常见的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。耐药性一旦出现,同源的PBPs染色体基因可部分转移至相关菌株,在细菌中快速扩散(克隆扩散)而造成严重威胁。抑制90%的菌株所需要的最低药物浓度(MIC 90 )的值可直接反映抗生素与PBPs的亲和性。

  3 细菌的细胞外膜通透性改变
    
  3.1 外膜通透性下降 G - 菌外膜通透能力变化较大,膜孔蛋白通道非常狭窄,能对大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障,外膜蛋白改变,引起膜通透性下降,减少抗生素吸收;G + 菌缺少菌外膜,所以不存在膜通透性下降的耐药机制。外膜通透性下降导致耐药产生主要由于:(1)膜 孔蛋白(F、C)缺陷;(2)多向性突变;(3)特异性通道的突变;(4)脂质双层改变。
   
  亚胺陪南对铜绿假单孢菌的活性,主要是通过一个特殊的孔蛋白通道OprD的扩散而实现的 [15] ,研究发现铜绿假单胞菌外膜通透性减低可以导致对各种结构不同的亲水性的抗生素产生耐药,其通透性低的原因主要与外膜上孔蛋白的结构与状态有关;其次与孔蛋白的数量减少有关。进一步研究发现孔蛋白OprC、OprD2、OprE和OprF在抗生素向菌体细胞的弥散中只起微不足道的作用,除了OprD2缺陷的菌株使得亚胺培南的最小抑菌浓度(MIC)比OprD2完整的菌株增加4~16倍,而OprF缺陷和OprF完整的菌株其MIC没有什么区别。在铜绿假单胞菌中,孔蛋白对抗生素弥散作用甚微,主要是由于孔蛋白通道的狭窄所决定 [16] 。外膜屏障使细菌对药产生固有的抗药性,且多数G - 菌产生β-内酰胺酶。研究表明,外膜屏障与β-内酰胺酶有明显的协同作用,即通透性降低的作用可使有效的酶灭活系统加强。
   
  3.2 生物膜(biofilm)的形成 生物膜是指细菌吸附于惰性或活性表面形成的,由细菌及其分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等胞外多聚物自然包绕形成的膜样物。胞外多糖复合物是形成生物膜的关键,其主要成分是藻酸盐,它的合成受细菌alC和alD基因控制 [17] 。但对于这两种基因的表达目前尚不清楚。
   
  生物膜是在细菌生长过程中,为了适应生存环境而形成的一种与游走细菌相对应的存在形式,有保护细菌逃逸宿主免疫和抗生素杀伤的作用,使细菌对抗生素的敏感性降低,是形成耐药的原因之一,由其引起的难治性感染是临床上亟待解决的问题之一 [18] 。但其作用机制尚不十分清楚,目前有渗透限制、营养限制和表型推断3种学说。虽然3种学说都被一定的实验所证实,但都不足以全面揭示生物膜的耐药性。
   
  Coquet等 [19] 研究了铜绿假单胞菌人工生物膜的形成对亚胺培南和妥布霉素的耐药性。生物膜细菌对两种抗生素单独或组合使用表现出比浮游细菌具有更高的耐药性。另外,在细菌悬浮状态下可以观察到亚胺培南和妥布霉素的协同作用,但在生物膜样结构中却没有发现二者的协同作用。生物膜铜绿假单胞菌耐药机制在于不仅有机械阻挡作用,而且可以吸附大量抗生素,降低其扩散和通透,难以消除细菌产生的抗药因子如β-内酰胺酶等。Bagge等人 [20] 认为有生物膜形成的铜绿假单胞菌其耐药性产生的主要原因是因为这些菌株更容易形成染色体β-内酰胺酶。近年来的研究表明,生物膜的信号传递系统对其形成和结构的稳定起关键性作用,被认为是消灭细菌生物膜最有希望的突破口 [21] 。
    
  4 细菌对药物的主动泵出
    
  抗生素的主动泵出系统是1980年Ball和McMurry在研究大肠埃希菌对四环素的耐药性时同时发现的,主要在G - 菌的天然耐药性和获得性耐药中起作用,其能量来源为质子移动力(proton motive force,PMF)。
   
  绿脓杆菌的多药主动泵出系统主要由3部分组成:(1)外膜蛋白:如OprM、OprJ或OprN,形成门隙通道;(2)内膜蛋白:如MexB、MexD、MexF或MexY,为主要的泵出蛋白,具有识别药物的作用,但不具有特异性;(3)膜融合蛋白:如MexA、MexC、MexE或MexX,连接内、外膜蛋白。这些主动外排蛋白组成4类主动泵出系统,即:MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM。对β-内酰胺类抗生素来说,其通过膜进入细胞,可能是在胞质膜蛋白中首先被分解,然后通过MexAB等泵出机制所吸收。β-内酰胺类抗生素在细胞内堆积达到某种临界浓度时,这些抗生素将会通过依赖质子梯度的这种活跃的泵出系统被排出体外。
   
  Nakae等 [22] 研究发现铜绿假单胞菌对β-酰胺类抗生素的耐药性是由于MexAB-OprM泵出系统和β-内酰胺酶的相互作用,但是它对青霉素结合蛋白(PBPs)突变体的耐药性的影响甚微。Kievit等 [23] 在研究发现:在生物膜铜绿假单胞菌中2种药物泵出系统耐药性相关基因的表达MexAB-OprM和MexCD-OprJ的表达不仅没有上调,反而降低,因此认为外排泵在生物膜铜绿假单胞菌的耐药中并不起作用。
    
  5 结语
    
  由于不同耐药菌株的耐药机制不尽相同,如上文所述,就同一菌株来说,对不同的β-内酰胺类抗生素的耐药机制也有所不同,所以各种β-内酰胺耐药菌所致的感染给当前抗感染治疗带来巨大挑战。除研发新型抗生素外,合理使用现有抗菌药物,密切监测细菌耐药性变迁,控制耐药菌株的播散和流行,是医药工作者面临的当务之急。
    
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  (编辑毅 文)

  作者单位:100050北京中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所


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