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两种精液处理方式的回顾性分析

来源:INTERNET 作者:黄玉玲 龙晓林 杜红姿 2005-7-29
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摘要: 【摘要】 目的 回顾性分析2002年6月~12月我科以上游法和Pure Sperm(硅烷化硅胶悬浮液)梯度密度离心法处理的精液在IVF-ET中的应用情况。方法 45例丈夫精液密度20~40×10 6 /ml,a级精子比例15%用Pure Sperm处理,其余用上游法处理。结果 Pure Sperm组处理前的精液密度,a级精子率及总活率明显低于上游组(P0。01),但......


【摘要】 目的 回顾性分析2002年6月~12月我科以上游法和Pure Sperm(硅烷化硅胶悬浮液)梯度密度离心法处理的精液在IVF-ET中的应用情况。方法 45例丈夫精液密度20~40×10 6 /ml,a级精子比例<15%用Pure Sperm处理,其余用上游法处理。结果 Pure Sperm组处理前的精液密度,a级精子率及总活率明显低于上游组(P<0.01),但处理后前组的密度高于后组(P<0.05),a级精子比例及总活力差异无显著性(P>0.05);Pure Sperm梯度密度离心处理组的a级及总活动精子的回收率高于上游组(P<0.05);两组的女方年龄、获卵数、受精率、卵裂率、优胚率、妊娠率及流产率差异无显著性(P>0.05)。结论 Pure Sperm处理法与上游法都可以不同程度的提高精子的质量:上游法简便,成本低,但对精液的参数要求高;Pure Sperm处理组a级精子及总活动精子的回收率高(43.4%,24.2%)于上游组,处理后可获得足够量的优质精子,不影响IVF-ET的各项参数,是相对于稍差精液的较好处理方法。 

关键词 精液 上游 梯度密度离心

在辅助生殖领域中,如何获得高质量的精子,是人们一直关注的问题,由此也产生了许多不同的精液处理方式。本文将对传统的上游法、Pure Sperm(硅烷化硅胶悬浮液)梯度密度离心法处理后的精液与IVF-ET中的各项参数的相关性进行回顾性分析,现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病人来源与分组 回顾分析我科2002年6~12月的224对不孕夫妇。男性的精液已在我院妇研室做过2~3次的精液分析,可行普通IVF-ET。其中男方取卵这次精液密度20~40×10 6 /ml,a级精子比例<15%者45例,用梯度密度离心处理,其余用常规上游法处理。

1.1.2 试剂 精子处理液:Earel’s+10%SSS+青霉素(6μl/10ml)+链霉素(7.5μl/10ml)Earel’s,Sigma,E2888;SSS(serum substitutes supplement),Irine;Pure sperm40/80,Spermbuffer,Nidacon labs,Cothenbury,Sweden.

1.2 方法

1.2.1 上游法 准备10ml处理液放入5%的CO 2 孵箱中平衡过夜。分析液化好的精液,记录精液参数,然后将其用巴氏管全部移到离心管内,加入1.5~2倍的精子处理液,轻轻吹打混匀后,用离心力150g离心8min,弃上清,加入2~3ml处理液,悬浮精子,再次离心,离心力100g,8min后,弃上清,留沉渣上1~2mm的洗液,轻轻弹松沉渣(密集的精子),加入0.5~0.8ml的精子处理液,以45°角放入CO 2 孵箱中上游45min~1h。上游完吸上层0.3~0.5ml精子浮液备用,检查精子参数。

1.2.2 梯度密度离心 试剂Pure Sperm40/80,先将2ml80%的Pure Sperm放入离心管底,轻轻的以1:1的形式在其上加2ml40%的Pure Sperm,最后将1.5~2ml的精液放在最上层;离心力300g,离心20min,弃上层精浆、40%与大部分的80%层Pure Sperm,然后用5ml Spermbuffer液混匀沉渣,离心力300g,离心10min,弃去上清,将收集到的精子制备成0.3~1ml左右的悬浮液,检查精液参数后放入CO 2 孵箱中备用。

1.2.3 精液参数分析 精液处理前后均按WHO的标准进 行常规分析。

1.2.4 授精方法 按常规,精液孵育4h左右,授精浓度1×10 6 /ml。

1.2.5 统计和分析 采用SPSS11.0软件进行统计和分析,检验采用t和X 2 检验。

2 结果

见表1~3。

表1 上游处理组与梯度密度离心处理组的精液参数情况 (略)

由表1以看出处理前梯度密度离心组精液的密度、总活力及a级精子的比例都比上游组差,差异有极显著性,但处理后却发现,梯度密度离心组的密度优于上游组,差异有显著性,总活力及a级精子比例方面差异无显著性。

表2说明梯度密度离心法的回收率优于上游法。 

表2 两种处理方法回收率比较 (略)

表3 两种方法处理组的IVF-ET各参数的比较 (略)

 两种处理方法均可以显著提高精液的总活力及a级精子比例,梯度密度离心在总活动精子回收率及a级精子的获得方面优于上游法。相对于参数稍差者的精液来说,用Pure Sperm梯度密度离心处理后,可获得足够量的活动精子及a级精子,不会影响IVF-ET的结局。

3 讨论

人类精液中除了精子外,还有许多其它成分,这些成分中有许多影响精子获能及顶体反应,从而影响精子的受精能力。报道较多的有以下几种:(1)白细胞:白细胞是人类精浆中产生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的主要物质,Sharma PK [1] 研究中报道,尽管WHO的检验手册中规定白细胞(WBC)<1×10 6 /ml,可以为正常,但他发现,只要可检测到WBC的存在,精浆中的ROS增加,抗活性氧能力下降(Total Antioidant Capcity,TAC),精子也将受到不同程度的损害。(2)油脂(lipils):鼠的精浆中过多的油脂存在影响精子的活力,通过上游或梯度密度离心的方法处理精液,可使油脂浮在洗精液的表层,而达到去除的目的 [2] 。(3)不成熟精子:死亡精子均可产生ROS [3] ,影响精子的活力和存活率。尽可能的去除精浆及非精子成分的方法有许多,其中运用最广泛、最多的即为上游法和Percoll梯度密度离心,曾 有报道 [4] ,精浆的分离方面,上游法最有效,其次为两层Percoll。而且也有人研究发现 [5] ,用上游法和梯度密度离心法结合处理获得的活精子可以将精浆的HIV和HCV病毒减少到目前检测不到的水平。

处理后的精子活力、质量及活动精子的精量与IVF-ET的各项参数十分相关,RhemreJp等人报道,洗后所有前向运动精子的计数(TPMC:Post-Wash),可预测TFF(Total Fertilization Failure) [6] 但如果活动精子总数>20×10 6 /ml,则对于妊娠率的提高方面并无一个确切的阈值 [7] 。从这里可以看出,足够的高质量活动精子的获得是减少不利IVF-ET成功因素的一个办法,而对于一些临界少弱精患者,好的精液处理方式可以使他们洗后的精液参数达到普通IVF-ET的标准,避免ICSI治疗而减少费用。

国内外许多文献均报道 [8,9] ,用上游法或Porcoll梯度密度离心法处理精液都可使精子的各项参数达到显著性提高。上游法相对于梯度密度离心法,试剂成本低,但上游法对精液的量、总活动精子数和总活动力的要求比较高;Perˉcoll梯度密度离心法,则要求较宽,尤其适用于精液参数稍差患者。但是目前Percoll已不能应用于临床 [3] ,但它的替代品可用;Pure Sperm即为其中一种。Pure Sperm是一种硅烷化硅胶悬浮液。曾有报道,硅烷化硅胶悬浮液法总精子回收率优于Percoll,但活力方面差异无显著性。目前,国内有王氏管分离精子的报道 [4] ,认为王氏法可使精子的活动率、正常形态精子率、精子顶体的完整率得到显著提高,处理未成熟DNA精子有良好效果,但成本高,不易推广使用。

基于以上分析及本研究都证明,上游法及硅烷化硅胶悬浮液(Pure Sperm)梯度离心方法回收率好,优质的活动精子获得率高,成本低,是目前辅助生殖领域中处理精液的良好方法。 

参考文献

1 Sharma PK,Pasqualotto AE,Nelson DR,et al.Relationship between seminal white blood cell counts and oxidative stress in men treated at an infertility clinic.J androl,2001,22(4):575-583.

2 Tanphaichitr N,Zheng Y S,Kates M,et al.Cholesterol and phospholipid leves ofwashed and pertoll gradient entrifuged mouse sperm:presence of lipids possessing inhibitory effects on sperm motility.Mol Rprod Dev,1996,43(2):187-195.


3 世界卫生组织编.人类精子及精子—宫颈粘液相互作用实验室 检验手册,第4版.北京:人民卫生出版社,2001,26-94.

4 Levay P F,Fourie F R,Bezuidenhout C,Koch A.Effectiveness of various sperm processing methods in removing seminal plasma from insemination media.Human-Reprod,1995,10(8):2056-2060.

5 Pasquier C,Daudom M Righil,Berges L,et al.Sperm washing and virus trans
mission in serodiscordant couples wishing to have children AIDS,2000,29:14(14):2093-2099.

6 Rhemrv Jp,MenKveld R,RoseBoom.TJ.et al.The acrosome index radiˉcal buffer capacity and number of isolated progressively motile spermatoˉzoa predict IVF results.Human Reprod,2001,16(9):1885-1892.7 Williams RS.Alderman J:Predictors of success with the use of donor sperm.Am


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