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广金钱草对胆色素结石的实验研究

来源:中华医学实践杂志 作者:刘 琼1,单春文2,张素中1,陈家树3 2011-6-29

摘要: 【摘要】 目的 探讨广金钱草对胆色素结石的作用机制。方法 用林可霉素对豚鼠造模1周,停药1周后灌服广金钱草高中低剂量和阳性对照药4周,空白组和模型组正常喂养4周。结果 广金钱草显著降低豚鼠胆囊结石率,对胆囊炎有治疗效果,并且能影响血液生化学指标和胆汁成分。结论 实验通过大体解剖、病理以及血和胆汁生化检......


【摘要】  目的 探讨广金钱草对胆色素结石的作用机制。方法 用林可霉素对豚鼠造模1周,停药1周后灌服广金钱草高中低剂量和阳性对照药4周,空白组和模型组正常喂养4周。结果 广金钱草显著降低豚鼠胆囊结石率,对胆囊炎有治疗效果,并且能影响血液生化学指标和胆汁成分。结论 实验通过大体解剖、病理以及血和胆汁生化检查,进一步证明广金钱草抗炎作用,尤其是对慢性炎症。通过抗炎保护了胆囊上皮,防止水肿和分泌大量粘蛋白,维护正常组织结构;同时降低胆汁粘度、DBIL、Ca2+和β-葡萄糖醛酸酶浓度,防止胆色素结石核心形成和结石的增大。抗炎恢复了胆囊的动力学环境,有消除胆汁淤滞的作用,故有排石作用。另一方面,保护肝细胞功能,促进肝细胞分泌胆汁酸,胆汁酸增加使游离胆红素的溶解度增加及钙离子沉积减少,阻止结石的产生。同时,肝脏分泌的增加有利胆作用。广金钱草通过以上几方面达到治疗胆色素结石。

【关键词】  广金钱草;胆色素结石;胆囊炎

 广金钱草作为四大南药之一,在民间运用历史悠久,被广泛用来治疗热淋、砂淋、小便涩痛、黄疸尿赤、尿路结石等[1]。目前有关它对胆结石治疗的研究较少,尤其是对胆色素结石的研究暂未见。已有研究表明广金钱草通过促进CCK分泌,达到增加胆汁流量、收缩胆囊、扩张奥狄氏括约肌从而达到利胆排石作用的[2]。卢兖伟[3]认为广金钱草总黄酮除具有防治肾结石的作用外,因其有显著的利胆作用,故对胆结石的防治作用值得进行深入研究。本研究在已有利胆研究基础上,全面探讨其对胆色素结石的治疗机制的研究,一方面为胆色素结石提供更多有效药物,另一方面丰富广金钱草药理学研究内容,为药材的单味药制剂和配伍提供药理学依据。

  1 材料与方法

  广金钱草制剂由中山大学新华学院药学实验室提供,采用水提醇浸法提取,含16.7g/ml生药。林可霉素(批号09112105。上海旭东海普药业有限公司生产)。消溶肝胆结石片(四川旭华制药厂生产)。豚鼠选用英国种健康短毛雌性豚鼠72只,体重(300±50)g,南方医科大学动物实验中心提供。

  1.1 动物分组和药物用量 采用随机分组法将其分成6组,空白对照组(A)、模型组(B)、广金钱草高剂量[32.4mg/(100g·d)]组(C)、广金钱草中剂量[16.2mg/(100g·d)]组(D)、广金钱草低剂量[8.1mg/(100g·d)]组(E)、消溶肝胆结石片[0.125mg/(100g·d)]组(F)。每组12只,每5只一大笼,分笼喂养,饲养的环境温度为15~25℃。

  1.2 动物胆色素结石模型制造 采用Scott方法[4,5],除空白对照组外,余5组分别给予豚鼠大腿根部(双后肢交替应用,以防皮肤坏死)皮下注射林可霉素,每日上午进行实验按6mg/100g体重给药,连续7天。

  1.3 实验步骤 第1、2周正常饲养,以适应环境。第3周造模,空白组在造模时皮下注射等量生理盐水,其余所有组动物注射林可霉素。第4周所有动物休息。第5周A、B组常规饲养,每天灌生理盐水1ml,C、B、E、F组灌胃给药。

  在实验期间,每周称量动物体重1次,每天记录实验室温度和湿度、动物精神状况、皮毛光度、活动情况、进食量、大小便等一般情况。每笼动物除每日自由饮水,并喂适量青菜。每日早晚定时喂养,并清洁豚鼠笼、饲料盆及水壶等。

  1.4 样本取材 第8周最后一天,灌药300min后,把受试动物处死前由心脏取血, 送生化检查。同时,迅速用血管钳阻断胆囊管,取下胆囊,肉眼观察胆囊外形、成石情况,并用注射器吸出全部胆汁,收集所有动物胆石,取材后分别送验。每组各取5只动物的肝和胆囊送病理检查。

  1.5 血清、胆汁生化和胆石分析 采用CL-7200全自动生化分析仪,测量胆汁中游离胆红素(UCB)、钙(Ca2+)、胆汁酸、β-葡萄糖醛酸酶含量及血液中谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、尿素氮(BUN)。胆石采用溴化钾压片法,测试仪器为双光束红外分光光度计。

  2 结果与分析

  2.1 动物的一般情况 第1、2周动物生长发育正常,没有死亡。第2周造模、第4周休息,空白组无死亡,其他各组共死亡10只。死前动物均出现精神萎靡不振、腹泻、皮毛倒竖无光泽、体重下降等症状,存活动物有精神欠佳、活动减少、皮毛无光泽、体重下降,最后逐渐到基本正常。在治疗期死亡2只,原因是灌胃操作不当致死。动物不同时期存活情况见表1。表1 实验过程中豚鼠存活情况 (只)

  对死亡的豚鼠进行尸体解剖发现肝脏大体标本有明显充血水肿,胆囊内有棕褐色脓性分泌物和少量淡黄色絮状沉淀物,并且经化验絮状沉淀主要为胆色素及胆色素盐。镜下可见肝细胞大量坏死,胆囊上皮有多处溃疡,胆囊各层有大量中性粒细胞浸润。

  分析:从死亡动物的大体解剖和病理检查可看出,林可霉素造模对实验动物的肝脏、胆囊的形态及功能均影响较大,因此造成动物出现精神、食欲和大小便改变等情况。

  2.2 体重变化 第1、第2周各组动物体重没有显著差异。第4周,动物经过造模和休整期,各组动物体重发生明显变化。所有动物造模后的体重与空白组比差异有显著性(P<0.01)。第8周,用药组所动物体重都增加,但高剂量组和阳性药与空白组比差异无显著性(P>0.05),而低、中剂量组与空白组和阳性药组比差异有显著性(P<0.05~0.01)。而模型组的动物体重有增加,但与空白组和阳性药组比差异有显著性(P<0.01)。详见表2。表2 动物体重的变化注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与阳性对照药比,▲P<0.05,▲▲P<0.01

  小结:体重变化反映药物对动物生长发育影响情况。林可霉素造模对动物生长发育影响较大。经药物治疗(治疗药和阳性对照药)动物的生长发育基本达到正常状态。说明药物对抗林可霉素引起的影响因素有明显的治疗和改善作用。

  2.3 胆囊成石情况 本次实验动物所生成的胆石多为棕黄色和淡黄色,大部分呈泥沙样,成形的体积大小不等,胆囊和胆管内均有发生。模型组和低剂量组胆囊壁增厚、粗糙明显,胆囊管壁增厚狭窄明显,有石胆汁呈粘稠混浊、深绿色。阳性药和高剂量组胆囊结构近似空白组,增厚不明显,无石胆汁淡黄色比较稀簿。中剂量组一部分呈现出高剂量组表现,一部分近似低剂量组,但胆汁粘度较轻。各实验组胆石发生情况,详见表3。表3 动物胆石发生情况 (只)注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与阳性对照药比,▲P<0.05,▲▲P<0.01 从表2可以看出各组成石率不同,模型组最高,成石率达89%,各给药组成石率低于模型组,其中空白组、阳性药组和高剂量组与模型组比差异有显著性(P<0.01)。模型组、中、低剂量与阳性药组比差异有显著性(P<0.05~0.01)。模型组、高、中、低剂量组与空白组比差异有显著性(P<0.05~0.01)。阳性药与空白组比差异无显著性(P>0.05)。

  分析:本方法制造豚鼠胆囊结石模型是成功的。药物可明显降低豚鼠胆囊结石形成率。(1)实验中林可霉素致动物胆色素结石,模型组成石率达89%,与文献报道基本符合[6]。阳性药和高剂量组明显降低胆色素结石形成,表明有明显的治疗作用,两者疗效相当。中、低剂量组结石数量有减少趋势,说明药物有一定改善效果。(2)胆汁的粘度和淤积对胆色素结石起到重要作用。从模型组和低剂量组胆汁与阳性药和高剂量组胆汁比较,以及胆囊壁和胆囊管情况,表明前者林可霉素影响了胆囊上皮分泌吸收和胆囊平滑肌的运动,出现胆汁淤积现象,而后者胆汁排泄通畅。

  2.4 血液和胆汁生化指标结果 受试动物于处死前由心脏取血,分离血清,用全自动生化仪测定血清中ALT、AKP、BUN。胆汁中测总胆汁酸、β-葡萄糖醛酸酶、钙、游离胆红素。详见表4、表5。表4 广金钱草对豚鼠血液生化指标的影响 注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与阳性对照药比,▲P<0.05,▲▲P<0.01表5 广金钱草对豚鼠胆汁成分的影响注:与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与阳性对照药比,▲P<0.05,▲▲P<0.01

  从表4可以看出ALT仅在模型组与空白组之间差异有显著性(P<0.05),而用药组与空白组之间差异无显著性(P>0.05)。模型组和低剂量组AKP与空白组比差异有显著性(P<0.05~0.01),而高、中剂量组和阳性药组与空白组比差异无显著性(P>0.05)。BUN在所有造模组与空白组之间差异无显著性(P>0.05)。

  分析:药物影响豚鼠血液生化学指标。(1) ALT升高表明林可霉素在造模时对肝脏细胞的损伤,造成肝细胞坏死。模型组ALT升高表明林可霉素对模型组肝细胞的损伤作用仍然存在,所有用药组ALT正常表明药物可能对有一定的修复保护作用。结果表明给药组动物用药后精神状态、活动、对刺激的反应及进食情况比模型组明显好,并且体重增加比模型组明显快,说明药物对肝有保护作用。(2)AKP降低表明经药物治疗后胆囊急、慢性炎引起的梗阻情况在阳性药和高、中剂量组中有明显改善,胆道通畅,同时在模型组和低剂量组中胆道狭窄和梗阻情况仍存在。在动物解剖的大体标本中也证实这一点。(3)BUN各组之间差异无显著性,表明造模和用药对动物肾功能没有影响。

  从表5结果看出 UCB、Ca2+和β-葡萄糖醛酸酶在模型组、低中剂量组与空白组和阳性药组比差异有显著性(P<0.05~0.01),胆汁酸在模型组、低剂量组与空白对照比差异无显著性(P>0.05),与阳性药组比差异有显著性(P<0.01)。而高剂量和阳性药组与空白组比差异无显著性(P>0.05),同时高剂量组与阳性药组比差异无显著性(P>0.05)。中剂量组与空白组和阳性药比差异有显著性(P<0.05)。

  分析:药物影响豚鼠胆汁成分。(1) 在模型组和低剂量组中UCB、Ca2+、β-葡萄糖醛酸酶的值与空白组比明显增高,表明胆汁中致石性成分的增高,促进了胆石形成和加大。(2)在阳性药和高剂量组中UCB、Ca2+、β-葡萄糖醛酸酶的值与空白组比较没有增高,表明胆汁中抑石成分增高,抑制胆石形成和加大。(3) 胆汁酸主要有由肝细胞分泌,它的浓度反映了肝细胞分泌功能。在阳性药和高、中剂量组中浓度增高表明肝细胞分泌胆汁旺盛。胆汁增加,对胆道起着冲刷作用,故药物通过加强肝细胞分泌功能,起着利胆排石作用。(4) 中剂量组UCB、Ca2+、β-葡萄糖醛酸酶和胆汁酸浓度有变化,不如高剂量,说明药物与胆石形成之间有量效关系。中剂量是参考人的用量设计的,表明单味药对胆结石治疗有一定效果,但是很有限。

  2.5 病理结果 A、D、E、F组胆囊无急、慢性炎症改变,B和C组有胆囊慢性炎症改变,并伴明显增生和狭窄。A、C、D、E、F组肝细胞无炎症反应,不伴有纤维增生。B肝细胞有散发的变性改变,无增生改变。

  分析:药物对慢性胆囊炎有明显的治疗作用。(1) 胆囊病理证明:模型组和低剂量组胆囊上皮有溃疡,部分上皮增生明显,表明正常胆囊的吸收上皮坏死脱落,影响胆汁的水、钠等无机盐的吸收,同时增生的分泌上皮分泌大量的粘蛋白,使胆汁pH值下降,胆汁致石力增强,加上粘蛋白是结石形成的基质,即粘蛋白凝胶包裹胆固醇单晶体或胆色素颗粒形成沉淀物。同时大量的炎性浸润肌层致平滑肌收缩功能障碍,造成胆汁瘀积。炎症刺激引起纤维组织增生,产生胆囊管狭窄,这些最终导致胆色素结石形成。(2) 相反阳性药和高剂量组胆囊上皮、肌层及纤维结缔组织的变化不明显,近似空白组,所以这些组动物基本没有出现泥沙样结石,或结石不明显。

  通过以上实验进一步证实了以往研究广金钱草有利胆和对胆囊炎的治疗作用外,还进一步证实了它对胆色素性结石的治疗作用。

  3 讨论

  3.1 胆色素性结石形成的机制 (1)人类胆石按其主要组成成分可分为胆固醇性、胆色素性及混合性,以混合性为多。胆固醇性结石又称为“代谢性结石”,它的发病与高胆固醇血症有密切关系。胆色素性结石又叫“感染性结石”,它的发病与胆道感染、炎症有关。

  目前有关胆色素性结石的形成原因尚不十分清楚。现有Maki学说和胆红素钙溶解-沉淀平衡失调学说[7],都认为UCB、Ca2+、β-葡萄糖醛酸酶和胆汁酸对胆色素性结石发生起重要作用。β-葡萄糖醛酸酶在感染时可水解成为非结合胆红素和葡萄糖醛酸。UCB与钙离子结合而析出胆红素钙沉淀。另外,感染的胆汁中的硫酸糖蛋白,把分散的胆红素钙沉淀微粒积集在一起,固化成结石。同时感染、胆道梗阻可使酶活性增强。

  胆红素钙溶解-沉淀平衡失调学说认为:胆红素钙在胆汁中的沉淀和溶解处于动态平衡中,受多种因素影响。(1)胆汁酸盐,它能与钙结合形成胆汁酸钙而使胆汁中的钙降低,同时胆汁酸盐对未结合胆红素有助溶作用,所以能防止或减少胆红素钙沉淀的生成。(2)糖蛋白,它是胆石形成的基质。另外,胆固醇、磷脂、葡萄糖醛酸对胆红素钙沉淀-溶解平衡有影响。

  影响胆色素结石形成的因素还有致石核心:50%~70%胆色素结石都有核心,主要是虫残体、细菌、脱落的上皮细胞等。

  3.2 林可霉素致动物胆色素结石的主要机制 林可霉素致动物胆色素结石的主要机制是早期诱发肝细胞和胆囊上皮坏死,造成肝细胞分泌“致石性病理胆汁”,之后,合并感染和异物刺激等因素,引起胆囊上皮炎造成胆囊吸收分泌异常,加重了“致石性病理胆汁”的成石性,同时胆囊运动功能失调,胆汁排泄不畅和瘀积,造成“致石性病理胆汁”在胆囊中储藏,加上坏死脱落的胆囊上皮、细菌和寄生虫残体形成胆色素结石的核心,进一步发展成为胆色素结石[7]。

  3.3 胆囊炎与胆石症 胆囊炎和胆石症二者可互为因果,相互影响。胆囊的炎症尤其是慢性胆囊炎必然影响胆囊壁的功能。胆囊炎时胆汁成分、代谢都受到影响,这些改变均成为形成胆石的基础。有人报道胆囊炎合并胆石者高达85%~90%,胆囊炎为结石形成创造了条件[6]。

  Maki学说和胆红素钙溶解-沉淀平衡失调学说[8],强调感染是胆色素结石形成重要因素。胆色素结石的发病与胆道感染及胆汁淤积有明显关系。感染是生石的“首要因素”,淤积是生石的“必要条件”。没有淤积,即使有感染也不易形成结石[6]。

  3.4 广金钱草对胆色素结石的作用机制[9~18] 已有广金钱草药理研究都证实:(1)抗菌和抗炎;(2)利胆;(3) 尿石的溶防作用;(4)利尿;(5) 对心血管系统的影响;(6)镇痛;(7) 其他。常压小鼠耐缺氧,广金钱草尚有益智作用等。

  本实验通过大体解剖、病理以及血和胆汁生化检查,也进一步证明广金钱草抗炎作用,尤其是对慢性炎症。通过抗炎保护了胆囊上皮,防止水肿和分泌大量粘蛋白,维护正常组织结构;同时降低胆汁粘度、DBIL 、Ca2+和β-葡萄糖醛酸酶浓度降低,防止胆色素结石核心形成和结石的增大。抗炎恢复了胆囊的动力学环境,有消除胆汁淤滞的作用,故有一定的排石作用。另一方面,保护肝细胞功能,促进肝细胞分泌胆汁酸,胆汁酸增加使游离胆红素的溶解度增加及钙离子沉积减少,阻止结石的产生。同时,肝脏分泌的增加有利胆作用。故广金钱草通过以上几方面达到治疗胆色素结石。

  综上所述,本实验研究进一步证实了以往对广金钱草的利胆和胆囊炎的治疗作用外,还进一步证实了它对胆色素性结石的治疗作用。

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