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降钙素基因相关肽对大鼠急性肺损伤的治疗作用及其可能机制

来源:中华医学实践杂志 作者:李贝华1,刘慧琳2,刘 涛3 2011-6-29
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摘要: 【摘要】 目的 研究降钙素基因相关肽(CGRP)对大鼠急性肺损伤(ALI)的治疗作用及其可能机制。方法 将24只SD大鼠随机分为3组,生理盐水对照组、内毒素(ETX)模型组、CGRP治疗组。通过颈外静脉插管给药,给药后4h处死动物,收集大鼠动脉血及肺泡灌洗液(BALF),测定动脉血氧分压(PaO2)及BALF总磷脂含量(TPL)、表面张力、......


【摘要】  目的 研究降钙素基因相关肽(CGRP)对大鼠急性肺损伤(ALI)的治疗作用及其可能机制。方法 将24只SD大鼠随机分为3组,生理盐水对照组、内毒素(ETX)模型组、CGRP治疗组。通过颈外静脉插管给药,给药后4h处死动物,收集大鼠动脉血及肺泡灌洗液(BALF),测定动脉血氧分压(PaO2)及BALF总磷脂含量(TPL)、表面张力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、总蛋白(TP)含量、碱性磷酸酶(AKP) 活性。结果 与对照组比较,给予ETX后大鼠动脉血PaO2下降,BALF中AKP、LDH活性升高、TP含量升高、表面张力升高、TPL含量下降,CGRP可明显改善ETX引起的上述指标的变化。结论 CGRP能明显减轻ETX引起的急性肺损伤,其机制可能与CGRP减轻AT-Ⅱ的损伤,促进PS的合成分泌有关。

【关键词】  降钙素基因相关肽;肺泡Ⅱ上皮细胞; 急性肺损伤

【中图分类号】  R-33        【文献标识码】  A        【文章编号】  1684-2030(2010)03-0129-04

  

  Effect and possible mechanism of calcitonin gene-related peptide on acute lung injury

  LI Bei-hua, LIU Hui-lin, LIU Tao.Hospital of 69250 PLA Troops, Urumchi 830013, China

  【Abstract】  Objective  To study the protected effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on alveolar type II cells (AT-Ⅱ) from acute lung injury (ALI) induced by endotoxin(ETX).Methods  24 rats were stochastic divided into 3 groups: control group were injected physiological saline from jugular; ETX group were injected ETX and physiological saline from jugular; CGRP group were injected ETX and CGRP from jugular. After four hours, the rats were sacrificed,then, collected the arterial blood and the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Surface tension, total phospholipids(TPL) and total protein(TP) of BALF were measured, and partial pressure of oxygen(PaO2) in arterial blood were detected; The activity of lactate dehydrogenase(LDH) and alkaline phosphatase(AKP) of BALF were detected.Results  Compared with the control group ,ETX increased the TP and the activity of LDH of BALF and decreased the PaO2(P<0 .05),which can be reversed by CGRP; TPL increased and surface tension decreased in ETX group(P<0.05),but no distinction between the CGRP group and the control group; CGRP prevented the increasing of the activity of AKP:control group (0.09±0.05) μkat/L,ETX group (0.48±0.12) μkat/L, CGRP group (0.24±0.08)μkat/L in BALF(P<0.05) induced by ETX.Conclusion  CGRP can protect the lung from injury by ETX. One of the possible mechanisms is that CGRP can protect the AT-Ⅱ and facilitate the synthesizing and secreting of pulmonary surfactants(PS).

  【Key words】  calcitonin gene-related peptide; alveolar type II cells; acute lung injury

  

  急性肺损伤(ALI)是由各种原因引起的常见的临床危重疾病,其发病机制复杂,且目前治疗手段有限,尤其到该病的严重阶段——急性呼吸窘迫综合征(ARDS),死亡率甚高。内毒素(ETX)引起肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)损伤及肺表面活性物质(PS)减少,使肺泡的表面张力增加,顺应性下降,导致肺不张,加重低氧血症,是ALI及ARDS的主要病理生理变化之一。降钙素基因相关肽(CGRP)主要分布于神经系统及心血管等组织,是近来倍受关注的神经多肽之一,由37 个氨基酸组成,肺内也有丰富的CGRP 神经纤维。CGRP参与多种体内生物功能调节,具有减少自由基产生、保护血管内皮细胞、促进心钠素释放、抑制ET-1产生等多种生物作用[1,2]。目前CGRP对ALI的治疗效果已经明确,但其作用机制尚不清楚。本实验拟利用ETX复制大鼠ALI模型,研究CGRP对AT-Ⅱ是否有保护作用,以期揭示CGRP对ALI的治疗作用机制,为治疗ALI提供新思路。

  1  材料与方法

  1.1  材料  成年SD大鼠24只,体质量200~250 g,雌雄各半,由新疆大学动物实验中心提供;CGRP、ETX购自美国Sigma公司;碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;725-C型分光光度计为上海第二分析仪器厂生产;IBL500 血气分析仪由Radiometer 公司生产。

  1.2  方法

  1.2.1  实验分组及模型复制  将大鼠随机分为3组:对照组(n=8),经大鼠颈外静脉插管注射等容积生理盐水; ETX组(n=8),经大鼠颈外静脉插管注射ETX 2mg/kg复制ALI模型,注射ETX后再立即注射与CGRP等容积的生理盐水;CGRP组(n=8),经大鼠颈外静脉插管注射ETX 2mg/kg后立即注射CGRP 1.5μg/kg。

  1.2.2  手术及标本采集  大鼠腹腔注射乌拉坦5ml/kg,麻醉满意后固定于鼠板,颈部正中切口切开皮肤,分离左侧颈静脉,插入塑料导管,按分组标准给药。给药后4h,先经左颈动脉插管取血0.5ml,然后行颈椎脱臼处死大鼠,行气管切开插管术,以生理盐水(20ml/kg体重)进行支气管肺泡灌洗,连续行3次,取第1次灌洗所得的肺泡灌洗液(BALF)0.2ml行BALF表面张力的测定,收集所有BALF,离心(3000r/min)10min,弃沉淀,取上清,留1.2ml用于测AKP、 LDH、 总蛋白(TP)等,剩余上清用于磷脂提取并定量。

  1.2.3  表面张力的测定  用毛细管法测定BALF表面张力[3],将毛细玻璃管垂直地插入到BALF中,精确测量管内外液面的高度差,根据拉普拉斯方程σ=rρg(h+r/3)/2计算BALF的表面张力。其中,σ表示表面张力(单位为 N/cm),r表示毛细管半径,ρ表示液体密度,g表示重力加速度,h表示内外液面高度差。

  1.2.4  总磷脂(TPL)的测定  采用Bartlett法[4](略有改良)测定BALF中TPL含量。BALF中加入2倍体积的氯仿-甲醇(2:1,v/v)萃取液,震荡1min,离心(2500r/min)10min,可见液体分层,弃上层液但保留界面杂质。加入1/4体积的甲醇-水(1:1,v/v)萃取液,震荡1min,离心(2500r/min)10min,可见液体分层,弃上层液及界面杂质,用氮气吹干,即得到萃取的磷脂,-20℃保存待测。将1ml高氯酸加入磷脂中加热,温度逐渐上升,直至颜色由黑变白,磷脂完全氧化,继续加热蒸干高氯酸。采用磷钼蓝比色法测定所得样本中无机磷含量。磷脂中磷含量约为4%,算出磷脂含量及每公斤体重磷脂含量。

  1.2.5  动脉血氧分压(PaO2)的测定  给药后4h后,经左颈动脉取血0.5ml,立即用ABL500 型酸碱仪测定其PaO2。

  1.2.6  BALF中AKP、LDH、TP的测量  根据试剂盒说明书测定AKP、 LDH 的含量。考马斯亮蓝G-250法测定TP含量。

  1.2.7  统计学处理  实验数据均以x±s表示,以方差分析进行统计学分析, P<0.05差异有显著性。

  2  结果

  2.1  CGRP对ALI的治疗作用  与对照组比较,ETX组BALF中LDH活性和TP含量升高、动脉血PaO2下降;与ETX组相比较,CGRP组BALF中LDH活性和TP含量均较ETX显著降低,动脉血PaO2明显升高(见表1)。表1 CGRP对急性肺损伤的治疗作用

  2.2  CGRP对AT-Ⅱ的保护作用  与对照组比较,ETX组BALF中TPL含量降低、AKP活性升高、表面张力升高;CGRP组BALF中表面张力和TP含量均较ETX组明显降低, TPL含量较ETX组显著升高(见表2)。表2 CGRP对肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用

  3  讨论

  ETX具有极强的生物活性,对人体毒性极大,且肺是ETX的主要靶器官之一,现已明确革兰阴性菌感染、内毒素血症是ALI、ARDS以及多器官功能不全发生的常见原因,故本实验采用ETX复制ALI模型。AT-Ⅱ具有合成分泌PS、增殖和修复、参与肺水转运及局部免疫等多种重要生理功能,AT-Ⅱ损伤是ALI发病的重要病理变化之一[5,6]。CGRP主要分布于神经系统及心血管等组织,是近来倍受关注的神经多肽之一,由37 个氨基酸组成,肺内也有丰富的CGRP 神经纤维。CGRP参与多种体内生物功能调节,具有减少自由基产生、保护血管内皮细胞、促进心钠素释放、抑制ET-1产生等多种生物作用[1,2]。简文等[7]已证实CGRP可提高动脉氧分压、降低肺动脉压。目前已明确CGRP可明显降低油酸致伤后血及BALF中TNF-α、IL-8和ET-1水平,抑制肺部炎性反应,减轻肺损伤[2]。故CGRP对ALI的治疗作用已明确,但作用机制尚待进一步研究。

  本实验中ETX可使BALF中LDH活性和TP含量升高、PaO2下降。BALF中TP含量升高表明肺泡渗出增加;LDH是细胞内酶,胞外LDH活性增加表明细胞损伤加重;PaO2是反映肺功能的直接的指标,也是评价ALI严重程度的重要指标之一,PaO2下降说明肺功能下降。给予CGRP可使上述指标的变化明显改善,表明CGRP对大鼠ETX性ALI的治疗有效。本实验中,ETX使BALF中TPL含量下降、表面张力升高、AKP活性升高。磷脂是构成PS的主要成分,TPL能反映PS含量变化,表面张力是PS质和量的综合反映。TPL和表面张力的变化证实ETX对AT-Ⅱ有损伤作用,并可抑制其合成、分泌PS,该结果与闫志强等研究结果一致[8],其机制可能为ETX对AT-Ⅱ的直接毒性作用及内毒素血症导致肺组织缺血、缺氧间接损伤AT-Ⅱ,导致PS合成和释放减少,肺表面张力增高。AKP是AT-Ⅱ的特异性标志物, ETX使BALF中AKP活性增强,表明ETX对AT-Ⅱ有损伤。给予CGRP后有效逆转了ETX引起的TPL、表面张力及AKP等指标的变化,证实CGRP可以减轻ETX引起的AT-Ⅱ损伤。

  综上所述,CGRP能显著减轻ETX引起的ALI,其机制可能与CGRP减轻AT-Ⅱ的损伤,促进PS的合成、分泌有关,但具体机制尚有待于进一步研究。

【参考文献】
   1 Lange M, Enkhbaatar P, Traber DL, et al. Role of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in ovine burn and smoke inhalation injury. J Appl Physiol, 2009, 107(1):176-184.

  2 Zhang BF, Lin YX, Qi HW, et al. Effects of calcitonin gene-related peptide on TNF-α,IL-8 and ET-1 concentration in blood and bron-chio-alveolar lavage fluid of rabbits with acute lung injury induced by oleic acid. J Fourth Mil Med Univ,2001,22(19).

  3 Yan ZQ, LiZC, Li ZB, et al. Effect of atrial natriuretic peptide on acute lung injury and the possible mechanism. J Fourth Mil Med Univ,2004,25(23):2199-2201.

  4 Bartlett GR.Phosphorus assay in column chromatography.Biol Chem, 1959,234(3):466-468.

  5 Uhal BD. Cell cycle kinetics in the alveolar epithelium. Am J Physiol, 1997, 272(6Pt1): 1031-1045.

  6 Zheng MQ, Wang SX, Pan CJ, et al. Changes of pulmonary tissue area density and their mechanisms in rat lung injury induced by endotoxin.Chin J Stereol Image Analysis,1999,4(4):251-257.

  7 Jian W, Qi HW, Li ZC, et al. Therapeutic effect of anisodamine, ANP and CGRP on oleic acid induced acute lung injury in rabbits. J Fourth Mil Med Univ,2002,23(1):19-22.

  8 闫志强,魏敏,田明明,等. 脂多糖对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用. 第四军医大学学报,2006,27 (20):1878-1880.

  


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