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鼠羊水栓塞肺病理变化及补体作用的探讨

来源:《中华医学实践杂志》 作者:胡国英,程晓慧,周学武 2008-6-30
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摘要: 鼠羊水组和胎粪液组注入前后补体C3、C4水平明显降低,差异有显著性(P0。 结论 补体系统在羊水栓塞中被大量激活、消耗,其活化裂解产生的片段引起中性粒细胞、巨噬细胞浸润及一系列病理变化,由此引起肺损伤及临床症状。 【关键词】 羊水栓塞。 补体 羊水栓塞(amniotic fluid embolism,AFE)是产科极为罕见......


【摘要】  目的 探讨鼠羊水栓塞后肺病理变化及补体的作用。 方法 精选雌性Wistar大鼠30只于妊娠20天制作羊水栓塞模型。根据注入液体性质不同随机分为对照组(10只)、羊水组(10只)、胎粪液组(10只)。对照组除注入生理盐水外,皆同其余组。实验后取大鼠左肺行HE染色光镜下观察,右肺行MPO检查,免疫比浊法测各组前后的补体C3、C4水平。 结果 (1) 实验组肺组织可见大量炎性细胞浸润,包括白细胞(主要为中性粒细胞)、巨噬细胞及少量淋巴细胞;MPO含量明显升高,差异有显著性。(2) 生理盐水组注入前后补体C3、C4水平差异无显著性(P>0.05);鼠羊水组和胎粪液组注入前后补体C3、C4水平明显降低,差异有显著性(P<0.01)。 结论 补体系统在羊水栓塞中被大量激活、消耗,其活化裂解产生的片段引起中性粒细胞、巨噬细胞浸润及一系列病理变化,由此引起肺损伤及临床症状。

【关键词】  羊水栓塞;肺损伤; 补体

   羊水栓塞(amniotic fluid embolism,AFE)是产科极为罕见的一种急症,羊水进入母体血循环后继发引起患者肺血管痉挛、休克及DIC为先导的多器官功能衰竭综合征。发生迅速、凶险,病理生理机制复杂。近年,国外学者研究发现羊水栓塞与补体的活化有关[1]。笔者检测了注入不同性状羊水后补体C3、C4水平的变化,探讨了补体在AFE中的作用。结果报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及分组 Wistar妊娠晚期大鼠30只,体重在230~350g之间,胎龄19~21天,由中国医科大学第二 临床学院实验动物中心提供。根据注入液体的性质不同随机分为3组:对照组(生理盐水)10只、羊水组10只、胎粪液组10只。

    1.2 大鼠羊水收集方法 术前12h禁食,饮水随意。按0.35mg/100g从腹腔注入10%水合氯醛麻醉。将孕鼠置于 鼠板上,固定头部和四肢,备皮,取下腹正中切口3cm,行子宫次全切除术,关腹。然后抽取羊膜腔内的羊水。

    1.3 胎粪液的制备 切开胎鼠腹壁,取下胎鼠大肠,轻轻挤压出胎粪或用原羊水肠腔冲洗液,配制成羊水混有胎粪的胎粪液。

    1.4 模型制备 大鼠行子宫次全切除术,关腹。分离右颈外静脉和左颈总动脉,左颈总动脉插管并接通三通管连接于二道生理记录仪连续监测MAP;右颈外静脉接通三通管,将制备好的注射液以2.5ml/kg的剂量从其注入。分别在注入前、后60min从鼠左颈总动脉插管处抽血2ml,所取血液标本经处理后冷藏于-70℃,待检。60min后由右颈外静脉注入10%KCl 5ml 处死动物。剪开胸、腹腔,取左肺、右肾、心、肝、肠道组织适量行组织形态学观察,右肺放入液氮中备用。

    1.5 主要设备与试剂 C3、C4 试剂盒购自北京利德曼生物技术有限公司。血压监测仪(Siemens),培养箱,低温超速离心机 (美国DU PONT-SORVALL SUPER-T21型),匀浆仪(Heidolph),7230型分光光度计。

    1.6 检测方法 免疫比浊法检测补体C3、C4,操作步骤按试剂盒说明书进行。 7230型分光光度计读取340nm波长处的吸光值(OD)。用试剂盒提供的标准血清作标准曲线,根据试剂盒提供的公式转换成C3、C4含量(mg/ml),并计算各组血清C3、C4平均含量(x±s)。C3标准浓度×标本吸光度/标准吸光度,其中C3标准浓度为2.0mg/ml,标准吸光度为0.0187;C4=标准浓度×标本吸光度/标准吸光度,其中C4标准浓度为4mg/ml,标准吸光度为0.137。

    1.7 MPO测定 将手术切除的右肺从液氮内随机分批取出,以生理盐水冲洗器官表面的血液,用滤纸沾干,称重。将样品融化后超声粉碎细胞成分(30s,3次),60℃水浴孵化2h;再用超速离心机35000g/min、4℃离心10min。取上清0.1ml加2.9ml反应液(0.167mg/ml邻联茴香胺的PBS和0.0005% H2O2)保持温度25℃,使用分光光度计(波长460nm)测量30s和90s的吸光度(A)值。 MPO活性(u/g湿组织)=△A×(13.5)。△A是460nm条件下30s到90s吸收率的变化。系数13.5由经验确定(1 单位MPO活性是减少1μmol过氧化物/min所需酶量)。

    1.8 统计学分析 所有计量数据用均数±标准差 (x±s)表示, 并进行t检验

    2 结果

    2.1 病理学检查 实验组肺组织轻度水肿,血管丰富,肺实质局部可见少量出血,血管及支气管周围可见大量炎性细胞浸润,包括白细胞(主要为中性粒细胞)、巨噬细胞及少量淋巴细胞。

    2.2 肺组织MPO含量 各实验组肺组织MPO含量较对照组升高,组间差异有显著性(P<0.01)。 各组MPO含量变化见表1。表1 各组肺组织MPO含量 注:与对照组相比,*P<0.01; 与胎粪液组相比,**P<0.01

    2.3 各组注入前、后血清中补体C3、C4的测定结果 生理盐水组注入前后差异无显著性(P>0.05);鼠羊水组和胎粪液组注入前后差异有显著性(P<0.01),见表2。表2 各组注入前后血清补体C3、C4水平注:vs注入前,*P<0.05,**P<0.01

    3 讨论

    羊水栓塞的病理生理是以肺血管痉挛、呼吸循环衰竭及DIC为先导的多器官功能衰竭综合征。尽管发生率低,但是死亡率却高达60%~80%[2,3]。以前认为栓塞是主要的病因,现在认为羊水进入母体内后激发内源性介质的释放是整个过程的关键。从发病机制上来说,认为在某种程度上羊水栓塞的临床症状从血流动力学及血液学上与过敏性休克和中毒性休克极为相似。但目前认为,AFE并不是IgE参与的I型变态反应[4]。Michael等认为AFE的发病机制可能是无抗体参加的过敏样反应,并将AFE称之为“妊娠过敏样综合征”。在此反应中异体物质引起肥大细胞脱颗粒,异常的花生四烯酸代谢产物产生,包括白三烯、前列腺素、血栓素等进入母体血循环引起一系列严重的病理生理变化[5]。研究证实这些递质引起的过敏反应和败血症反应的确与羊水栓塞综合征的临床症状和凝血机制紊乱直接相关,也可以说羊水栓塞综合征事实上是一种类过敏反应综合征。Michael等在2001年对AFE研究发现补体激活可能起主要作用,尽管他们没有测量羊水栓塞孕妇血清补体的变化[1]。

    补体系统由30余种膜蛋白及血浆蛋白组成,是体内复杂的有限蛋白水解系统。在正常生理状态下,补体在清除病原微生物、处理免疫复合物等方面发挥重要作用,但其异常过度活化是许多临床疾病发生的基础[6,7]。

    本研究发现,注入大鼠羊水及胎粪液后血清补体C3、C4平均含量明显降低,说明补体系统在羊水栓塞中被大量激活、消耗,可能在其发病机制上起重要作用。补体系统被激活完成对抗原及异物的清除过程,在此清除过程中补体产生大量的具有炎性介质活性的片段,如C3a、C4a和C5a等。C3a、C4a和C5a被称为过敏毒素,能与肥大细胞、嗜碱性粒细胞等表面相应的受体结合,促进组织胺、类胰蛋白酶之类的血管活性介质释放,增加血管通透性,加重局部血液循环障碍。同时C5a还是一种有效的趋化因子,可刺激中性粒细胞循Ca5浓度梯度运动[8]。在中性粒细胞释放的多种炎性介质的作用下,引起内皮细胞水肿和损伤,过量时则使内皮细胞损伤和死亡,并严重制约血管体系对内皮素(ET)、血管紧张素(A )和CA等缩血管物质的反应性,导致血管广泛或过分扩张,周围循环障碍,血压下降,使微循环处于瘫痪状态[9,10]。

    髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)存在于中性粒细胞(PMN)的嗜天青颗粒中,PMN激活时部分MPO可以释放,因此MPO可作为中性粒细胞的标志物,敏感地反映出组织中性粒细胞浸润的程度 [4]。笔者测定羊水栓塞后的动物肺组织MPO的变化,胎粪液组升高明显,说明除了胎粪液内含有的有形成分造成机械栓塞外导致较多的中性粒细胞浸润外,羊水栓塞中大量的补体被激活、消耗,其活化裂解产生的片段C5a是很强的白细胞趋化因子[11],它可募集激活白细胞,导致白细胞的浸润聚集以损伤肺组织,本实验已经证实了这一点。在病理切片观察中,笔者发现了多量的巨噬细胞及中性粒细胞,这些结果提示,炎性反应参与了羊水栓塞造成的肺损伤,推测不仅混浊羊水栓子对循环中的中性粒细胞有化学趋向的作用,而且补体被激活后募集激活白细胞至肺内,进而肺中性粒细胞衍生的氧化剂及蛋白酶引起肺微血管损伤。白细胞向各个器官的实质细胞浸润,同时在局部通过呼吸爆发产生氧自由基,并释放溶酶体酶、前列腺酶、白三烯和PAF等多种炎症介质,引起各生命器官毛细血管内皮细胞损伤、通透性增高,导致实质细胞损伤。

    补体的激活,裂解片段的产生,细胞进一步被活化并产生和释放许多毒性氧自由基、花生四烯酸及细胞因子,这些细胞因子在羊水栓塞动物模型中已经发现,白三烯、花生四烯酸的代谢产物在羊水栓塞时起到了一定的作用[8,9]。最终由于补体的过度激活,直接与间接地导致了机体自身组织的损伤。

    本研究提示补体的大量激活可能是羊水栓塞的始动环节,在此基础上发生以肺血管痉挛、呼吸循环衰竭及DIC为先导的多器官功能衰竭综合征。但目前关于补体在羊水栓塞中的作用机制的研究尚少,其在羊水栓塞中的确切的分子生物学机制仍待进一步实验研究。

【参考文献】
  1 Michael D,Benson MD,Richard K,et al.Immunologic studies in presumed amniotic fluid embolism. Obstet Gynecol,2001, 97: 510-514.

2 Clark SL, Hankins GD, Duldley DA, et al. Amniotic fluid embolism: analysis of the national registry. Am J Obstet Gynecol,1995,172:1158.

3 Burrows A, Khoo SK. The amniotic fluid embolism syndrome: 10 years experience at a major teaching hospital. Aust New Ireland J Obstet Gynecol,1995,35:245.

4 Benson MD. Anaphylactoid syndrome of pregnancy [letter]. Am J Obstet Gynecol,1996,175:749.

5 Benson MD,Lindberg RE. Amniotic fluid embolism, anaphylaxis and tryptase.Am J Obstet Gynecol,1996,175:737.

6 Negoro NM,Okamura T, Taketa T, et al. The clinical sig- nificance of iC3、C3 neoantigen expression in plasma from patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum,1989,32(10):1233-1242.

7 Earis JE, Marcuson EC, Bernstein A. Complement activation after myocardial infraction.Chest,1985,87(2):186-190.

8 张振钧,杨尉梅,华嘉增.羊水栓塞75例分析.现代妇产科进展, 1997,6(3):229-232.

9 余艳红,金志魁, Bahramis,等.羊水栓塞血浆对离体肺循环的影 响.中华妇产科杂志,1997,32(3):136.

10 Lachmann PJ.The control of homologouslysis.Immunol Today, 1991,12:312-315.

11 Fernandez HN, Henson PM, Oranl A, et al. Chemotactic response to human C3、C4 and anaphylatoxins evaluation of C3、C4 and C5a leukotaxis in vitro and under simulated in vivo conditions. J Immunol, 1978,120:109-115.


作者单位:1 163453 黑龙江大庆,大庆油田总医院集团龙岗社区卫生服务中心 2 163001 黑龙江大庆,大庆油田总医院集团龙南医院妇产科


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