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三种不同配比的保护剂对人类精子冷冻复苏后活动能力的比较

来源:《中华医学实践杂志》 作者:胡京美,许成岩,房玉英,李 媛,陈子江Δ ,郭康和, 2008-6-30

摘要: 【摘要】 目的 比较添加葡萄糖与添加不同浓度蔗糖的冷冻保护剂对人精子冷冻复苏后的活动能力的影响。方法 将47份志愿者的标本分别采用三种不同的保护剂冷冻,比较精子复苏后的活动力。 结果 冷冻前:前向活动精子百分率、总活动率分别为(60。采用添加葡萄糖的冷冻保护剂冷冻复苏后的前向活动精子百分率、总活动率分......


【摘要】  目的 比较添加葡萄糖与添加不同浓度蔗糖的冷冻保护剂对人精子冷冻复苏后的活动能力的影响。方法 将47份志愿者的标本分别采用三种不同的保护剂冷冻,比较精子复苏后的活动力。 结果 冷冻前:前向活动精子百分率、总活动率分别为(60.4±6.4)%、 (67.3±6.0)%;采用添加葡萄糖的冷冻保护剂冷冻复苏后的前向活动精子百分率、总活动率分别为(41.6±9.8)%、(50.7±10.2)%;采用添加0.1M蔗糖的冷冻保护剂冷冻复苏后的前向活动精子百分率、总活动率分别为(39.9%±8.0)%、(49.8±8.4)%;采用添加0.2M蔗糖的冷冻保护剂冷冻复苏后的前向活动精子百分率,总活动率分别为(29.7±7.7)%、(39.5±7.4)%。冷冻前后精子的前向活动百分率和总活动率差异有显著性,添加葡萄糖保护剂与0.1M蔗糖的保护剂相比差异无显著性但两者与添加0.2M蔗糖的保护剂比较差异有显著性。结论 冷冻对精子的活动力损伤明显;添加蔗糖作为精子的冷冻保护剂是可行的,较低浓度的蔗糖较高浓度的效果好。

【关键词】  精子;蔗糖;冷冻保护剂;冷冻复苏;活动力

    Impact of three different cryoprotectants on motility of post-thaw human sperm

    HU Jing-mei,XU Cheng-yan, FANG Yu-ying,et al.Reproductive Medical Center of Shandong Provincial Hospital,Shandong University,Jinan,250021,China

    【Abstract】 Objective To compare the cryoprotectant containing glucose or different concentration of sucrose on the motility of post-thaw human sperm.Methods The author applied three different cryoprotectants on forty-seven semen samples to compare the motility of post-thaw human sperm.Results Before cryopreservation,the forward motility rate and total motility rate are (60.4±6.4)%,(67.3±6.0)%;the forward motility rate and total motility rate of post-thaw human sperm by adding glucose are (41.6±9.8)%, (50.7±10.2)%;and by adding 0.1M sucrose are (39.9±8.0)%,(49.8±8.4)%;and by adding 0.2M sucrose are (29.7±7.7)%,(39.5±7.4)%.There is significant decrease motility after cryopreservation. Between by adding glucose and 0.1M sucrose,there is no difference between the two different cryoprotectants.But by adding 0.2 Msucrose,there were significantly decrease than the two other cryoprotectants.Conclusion The injury of cryopreservation to sperm is proved. It is feasible to apply sucrose as a kind of sperm cryoprotetant.Moreover the best concentration of sucrose need to be modified by further experiments.

    【Key words】 sperm;sucrose;cryoprotectant;post-thaw;motility

    自世界首例报道用甘油作为冷冻保护剂冻存精子已经有50多年了,获得成功后,对于精子的冷冻保存并没有获得更大的改进。本实验在保持甘油浓度不变的前提下对添加葡萄糖和添加不同蔗糖浓度配制的三种保护剂对精子进行冻存以判断哪种保护剂对精子冻存后效果更好。

    本中心常规应用葡萄糖甘油为小分子的细胞内保护剂,众所周知蔗糖作为细胞外的非渗透性的冷冻保护在胚胎冷冻中作为常规的应用而且效果很好,所以将其应用于精子的冷冻具有可行性 。已有研究证实精子的活动力和活动率与精子的生育力明显相关,而且卫生部对精子库的精子冻存质量以复苏后精子前向运动的活动率作为直接指标,本研究也以复苏后精子的活动率为指标比较两种不同种类冷冻保护剂的有效性。

    1 材料与方法

    1.1 精液的收集 精液来自2006年12月~2007年1月到山东省立医院人类精子库捐献的体检合格志愿供精者共47例,禁欲2~7天,供精年龄22~35 岁,取精前消毒手及外生殖器,手淫法将标本留在无菌皿中。

    1.2 冷冻保护剂的配制 按照Manavedan等[1]的方法配制含葡萄糖的保护剂,蔗糖作为保护剂参考Amjad Hossain的实验[2]将其浓度配为0.1M,0.2M。甘油、蛋黄等必须用保护剂浓度不变,调pH值于7.2。用0.22μm的过滤器除菌后加入庆大霉素。

    1.3 精子的检测及冻存 精子在37℃5%CO2培养箱中液化后,按照世界卫生组织《人类精液和精子宫颈黏液相互作用手册》(第4版)进行精液常规分析[3],按卫生部标准[4]对a+b>50%,精子密度>6000万,精液量>2ml的标本进行冻存。以1:1的比例加保护剂,每份标本用含葡萄糖和不同浓度蔗糖的保护剂冻三管,在冷冻前平衡10min。所有标本用PLANNER程序冷冻仪进行操作,从20℃开始以- 1℃/min的速度到-2℃(holding 5min),然后以-10℃/min的速度到-3℃,然后以-6℃/min的速度到-20℃,接着以-10℃/min的速度到-90℃,最后直接投入-196℃液氮中储存。精子储存72h后复苏,方法是标本从液氮中取出后立即置于37℃ 水浴箱中10min。为防止检测者的偏差所有标本的操作均由笔者一人完成。

    1.4 精子活力的分析 使用NIKON相差显微镜,采用MARKLER精子记数板在20倍物镜下记数两个板的随机20个小格,所看到的前向活动精子总数(WHO分类中的a级和b级)和精子总数,两者相除×100%即为前向活动精子百分率。

    1.5 统计学分析 采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析,检测数据用x±s表示,均值比较采用t检验。P<0.05为差异有显著性。

    2 结果

    见表1。 表1 3组冷冻效果分析

    2.1 冷冻后a+b 一组和三组比较,P<0.05,差异有显著性。一组和三组比较,P<0.05,差异有显著性。一组和二组比较,P>0.05,差异无显著性。

    2.2 总活率 一组和三组比较,P<0.05,差异有显著性。二组和三组比较,P<0.05,差异有显著性。一组和二组比较,P>0.05,差异无显著性。

    3 讨论

    在辅助生殖中,精子冷冻的应用越来越广泛。目前由于工作的压力还有环境的污染更多的是由于男性因素的不育对冷冻精子的需求也更高。用人工授精的方法是解决此问题的有效方法,而冷冻精子具有使用方便、避免感染病毒的优点在临床上得到广泛的应用。

    在正常情况下只有具有前向活动的精子才能使卵子受精,也有研究证实精子的活动力和活动率与精子的生育力明显相关,卫生部对精子库检测质量的一个主要指标就是前向运动的百分比。因此,对如何提高冷冻后精子的活动率提供合格优质的标本是当前精子库工作的重点。

    冷冻复苏的过程对精子都会造成损伤,主要是细胞内冰晶的形成和溶液效应。甘油是最早使用的保护剂,精液加入甘油后很快进入渗入精子细胞内,降低细胞内液的冰点,减少冰晶的形成,起到保护精子的作用,精子与保护液作用10min的精子活力最好。精子内含90%的水,甘油冷冻剂的作用是与精子细胞内水与电解质结合,导致水合蛋白结构的稳定,有良好的抗冻作用,同时也减低了细胞内外溶液电解质改变对细胞的损伤。甘油的最终浓度为5%~10%,过高会引起精子顶体颈部的损害以及尾部的弯曲,尤其以精子尾部的扭曲和变形较多,复苏后精子形态发生变化,影响到精子的受精能力,笔者用的浓度是7.5%。国外已较多的报道证实卵黄液孵育哺乳动物精子可以增加ARR,原因可能是卵黄液降低精子膜上胆固醇/磷脂的比例,从而导致精子获能数的增加,或可能是由于卵磷脂、脂蛋白在精子膜上某些离子通道的开启,加速精子获能并促进了顶体反应[5,6]。

    冷冻复温过程中精子超微结构变化的主要原因是水分内移, 细胞肿胀,因此,要提高精子的能量代谢, 获得较高的精子复苏率和活力, 必须保护细胞膜的完整和通透性的稳定, 这是防止冷冻损伤的重要环节[7]。葡萄糖是小分子的细胞内冷冻保护剂,能够穿过细胞膜调节细胞内外的渗透压,防止过多的水分内移,起到保护作用,是我们目前常用的保护剂。而蔗糖是细胞外非渗透性冷冻保护剂,在胚胎冷冻中起到很好的效果,它不能穿过细胞膜,通过提高细胞外液的浓度而产生跨膜的渗透压梯度,将水分从细胞内吸出,从而引起细胞脱水,发挥非特异性保护作用, Amjad Hossain等的实验研究表明蔗糖可用于精子冷冻的浓度范围是0.1~0.3M,笔者以0.1M、0.2M实验[8]。本研究的结果表明分别用添加葡萄糖和0.1M蔗糖的保护剂对精子冷冻后前向精子的活动率及总活动率均没有统计学上明显的差异,说明用蔗糖作为冷冻保护剂冻存精子是可行的,但是总体上较用葡萄糖的低,0.2M明显低于0.1M说明高浓度的蔗糖在精子冷冻中是不合适的。本实验国内鲜有报道,我们会进一步的实验对蔗糖配方浓度进行改进从而找到更好的方法来提高精子的冻存率。

【参考文献】
  1 Mahadevan MM, Trounson AO. Effect of Cryoprotective and dilution methods on the preservation of human spermatozoal.Andrologia,1983,15:35.

2 Kira P,Nallella,Rakesh K,Sharma,et al.Cryopreservation of human spermatozoa:Comparison of two cryopreservation methods and three cryoprotectants. Fertil Steril,2004,82(4):913-918.

3 世界卫生组织.人类精液和精子宫颈黏液相互作用手册,第4版.北京:人民卫生出版社,2001,5-6.

4 卫生部卫科教发.人类辅助生殖技术和人类精子库伦理原则,(2003)176号文件.

5 Trummer H, Tucker K, Young C, et al. Effect of storage temperature on sperm cryopreservation.Fertil Steril,1998,70(6):1162-1164.

6 Hossain A, Islam N, Caruso A, et al. Human sperm cryopreservation using sucrose as a cryoprotectant shows a promising future.Fertil Steril,2003,80(3):239-240.

7 Donnelly ET, McClure N, Lewis SEM.Cryopreservation of human semen and prepared sperm:effect on motility parameters and DNA integrity.Fertil and Steril,2001,76(5):892-900.

8 Gary N,Clarke.Sperm cryopreservation:Is there a significant risk of cross-contamination. Human Reproduction,1999,14:2941-2493.


作者单位:250021 山东济南,山东大学山东省立医院生殖医学中心(Δ通讯作者)


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