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双向电泳在大鼠脊髓蛋白质组分析中的应用

来源:中华医学实践杂志 作者:景爱红 ,徐旭东, 王廷华 2007-4-26
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摘要: 双向电泳在大鼠脊髓蛋白质组分析中的应用 (pdf) “人类基因组计划”测定DNA序列工作的完成,宣告“后基因组时代”的开始。人体内蛋白质分子结构和功能异常是疾病发生和发展的主要原因。蛋白质科学与技术进步成为本世纪生命科学领域争夺最激烈的前沿。蛋白质组学被视为分子生物学的大规模筛选技术,目前双向电泳(two-dime......


    双向电泳在大鼠脊髓蛋白质组分析中的应用 (pdf)

    “人类基因组计划”测定DNA序列工作的完成,宣告“后基因组时代”的开始。人体内蛋白质分子结构和功能异常是疾病发生和发展的主要原因。蛋白质科学与技术进步成为本世纪生命科学领域争夺最激烈的前沿。蛋白质组学被视为分子生物学的大规模筛选技术,目前双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白混合物的首选技术之一。所谓双向电泳,第一向根据蛋白质的等电点不同,分离蛋白质;第二向将等电点相同的蛋白质,根据分子量不同再次得到分离。与通常的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相比,能获得更多的信息。

    1  双向电泳中蛋白样品的制备是关键环节

    SD大鼠用2%的戊巴比妥钠进行腹腔麻醉,活体状态下取出脊髓,加入裂解液,用玻璃匀浆器研磨至无肉眼可见沉淀物为止。加RNA酶和DNA酶,静置15min,离心,取上清。样品制备过程中,应使所有待分析的蛋白样品处于溶解状态,且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生聚集和沉淀;避免制备过程中发生样品的抽提和化学修饰;尽量去除样品中的核酸和某些干扰蛋白;尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证目标蛋白质的可检测性。样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质最关键的因素之一。溶解的目标是样品中非共价结合蛋白质复合物和聚积体完全破坏,从而形成各个多肽的溶解液。溶解的方法尽可能去除干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质,并保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段:在样品裂解液中加入变性剂、尿素和硫脲,改变溶液中氢键结构,降低接近疏水残基的能量域,使蛋白质充分伸展,完全暴露其疏水中心。在裂解液中加入表面活性剂—两性离子去污剂CHAPS,溶解由变性剂暴露的疏水基团。在水化上样缓冲液中加入还原剂DTT(二硫苏糖醇),使已变性的蛋白质完全展开,溶解更彻底。在水化上样缓冲液中加入两性电解质,作用在于捕获样品中的少量盐分,从而保证蛋白质的溶解性,否则这些蛋白质在其处于等电点时会发生沉淀。应用两性电解质的浓度应小于0.2%(V/V),浓度过高会使等电聚焦的速度降低。

    2  固相pH梯度胶条(IPG)的选择

    胶条pH值范围的选择,一般是先宽后窄,为了确保实验的精确性,使用的两性电解质pH值范围应与IPG的pH值相符。检测大鼠脊髓中全部蛋白质,一般选择pH值3~10的胶条。

    3  蛋白样品的双向电泳

    3.1  胶条的水化  一般温度(室温20oC),采用被动水化;温度过低,为了避免样品在胶条析出,采用主动水化。水化上样缓冲液与脊髓蛋白样品、DTT和Bio-lyte室温(20OC)充分混合不少于30min,水化缓冲液的量应与胶条长度成正比。将胶条室温解冻10min,揭去表面塑料膜,使胶面向下浸于水化液中1h,待水化液完全被IPG胶条吸收,防止样品挥发,在胶条上面覆盖一层矿物油。一般水化时间以12~14h为宜。如果水化时间过短,胶条没有充分泡胀,样品蛋白没有完全进入胶条;时间过长,容易造成样品丢失。

    3.2  第一向电泳—等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)  用四蒸水浸湿的滤纸搭在聚焦盘两端的电极上,作为盐桥,可达到除盐的目的。用蒸馏水搭湿的滤纸吸去胶条表面的矿物油及残余样品。胶条正负极分别与聚焦盘正负极上湿润的滤纸充分接触,胶条表面覆盖矿物油,小心赶走胶条下面的气泡。然后设置等电聚焦程序,以低电压开始聚焦,利于低分子量蛋白进入胶条;但是低电压时间过长容易造成样品丢失。聚焦过程应采用快速升压,聚焦结束以达到总的伏特小时为准,使样品最终能达到等电点处于稳态。如果聚焦电压太高,容易造成胶条被击穿现象。

    3.3  胶条的平衡  重泡胀和等电聚焦结束后,用四蒸水打湿的滤纸充分吸干胶条上的矿物油和多余的样品,把胶条放入平衡液Ⅰ中,于摇床摇振15min,再于平衡液Ⅱ中摇床摇振15min。

    3.4  第二向电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  用滤纸吸去胶条上多余的水化液及样品,将胶条转移至事先制好的聚丙烯酰胺凝胶上,转移时注意胶条支持膜紧贴长玻板,胶面朝向短玻板。0.5%的琼脂糖封胶液于微波炉加热至沸,室温冷却低于70℃时,用移液枪加于胶条上面固定胶条。电泳槽通循环水流,起始电压设为70V,待溴酚蓝指示线越过IPG胶条,将电压设为300V直至电泳结束。

    4  凝胶的染色与图像采集

    电泳完毕后的凝胶使用银染色,经过固定、敏化、显影、定影,Image Master 2D Elite(Demo)软件采集并分析图像。如果发现有意义差异蛋白点,需进一步检测分析,可结合质谱分析技术测定蛋白质肽质量指纹图谱,进行蛋白数据库搜索以获得更多有关目标蛋白质的信息。

   作者单位:1 272013 山东济宁,济宁医学院解剖学教研室

    2 云南昆明,昆明医学院神经科学研究所

   (编辑:齐  永)


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