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脐带血NKT细胞的体外扩增及其表型研究

来源:中华医学实践杂志 作者:刘 范华骅 阮鸣 高跞 聂晓绚 杨懿铭 陆华中 高 峰 2006-8-20

摘要: 【摘要】 目的 建立体外有效扩增脐带血NKT细胞的方法及其表型的研究。方法 分别采用单加IL-2,及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法,从人脐带血单个核细胞(UCB-MNCs)中扩增NKT细胞。用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+ TCR Vβ11+)的比例及其他表型特征。结果 UCB-MNCs在第7天时,其TCR Vαβ......


  【摘要】  目的  建立体外有效扩增脐带血NKT细胞的方法及其表型的研究。方法  分别采用单加IL-2,及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法,从人脐带血单个核细胞(UCB-MNCs)中扩增NKT细胞。用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+ TCR Vβ11+)的比例及其他表型特征。结果  UCB-MNCs在第7天时,其TCR Vαβ+ NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±4.19)%,是原来的(8.74±4.37)×102倍 ( P<0.01),且大多不表达NK1.1(CD161);TCR Vβ11+较TCR Vα24+高表达。结论  α-Galcer对脐血NKT细胞有特异地扩增功能。以表型划分,脐血中的NKT细胞多为NK1.1-,一种新的NKT细胞亚型。
   
  【关键词】  脐带血; NKT细胞;α-Galcer;细胞表型

  The proliferation of natural killer T cells in umbilical cord blood  and the different phenotype between them
LIU Yan, FAN Hua-hua, RUAN Ming,et al.Shanghai Blood Center, Shanghai 200051,China.

  【Abstract】  Objective  The first objective of this study was to establish an effective method to proliferate natural killer T (NKT) cells in umbilical cord blood (UCB). The second one was to study the phenotype.Methods  Mononuclear cells (MNCs) from UCB were cultured in the presence of IL-2 (100U/ml), with or without alpha-galcer. TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells and its other phenotypes were determined by flow cytometry. Results  After 7 days expansion, TCRVαβ+ NKT cells from UCB-MNCs increased(8.74±4.37)×102 times, but most of them did not express NK1.1 and its TCR Vβ11+ was higher than TCR Vα24+. Conclusion  Human TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells can expand following the administration of alpha-galcer. Most of the UCB-NKT was NK1.1-, a new subset of NKT cells.

  【Key words】  umbilical cord blood; natural killer T (NKT) cells; alpha-galcer; phenotype

  脐带血是一种来源广泛的新资源,其中的低免疫原性细胞正日益受到人们的关注。近研究发现,构成机体免疫系统的淋巴细胞中,除T、B、NK细胞外,还存在一种新的细胞系—NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效,而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性,增强其细胞毒效应,抑制GVHD的发生。但是,NKT细胞在脐血中的含量极少,很难用于临床研究和治疗。本文拟探讨一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法,并同时分析它的表型特征,现报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  试剂与仪器  Ficoll-Paque细胞分离液(Phamarcia公司);12孔细胞培养板(Corning公司);RPMI1640培养基(Gibico公司);KRN7000(αlpha-galactosylceramide,简称α-Galcer,日本麒麟公司惠赠,100ng/ml);IL-2(R&D公司);PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体(Immunotech公司);6%羟乙基淀粉生理盐水溶液(B.Braun公司);EPICS ELITE ESP型流式细胞仪(Beckman-Coulter公司)。

  1.2  方法

  1.2.1  脐带血单个核细胞(UCB-MNCs)的制备  新鲜采集的正常人脐带血以ACD-B抗凝血袋收集,继以体积比4:1加入6%HES液中,吹打均匀后4℃下静置1h,吸取中间白膜层用0.6%ACD-PBS对倍稀释,混匀后以2:1的比例加入Ficoll上层,离心(2000rpm,20min),取中间细胞环,PBS洗3次,悬浮于含10%FCS的完全培养液中。

  1.2.2  脐带血中NKT细胞的扩增  将新鲜分离的UCB-MNCs接种于含10%FCS完全培养液的12孔细胞培养板中,每实验孔接种密度为5×105/ml,分设实验组MNCs+ IL-2(5u/ml)和MNCs+α-Galcer(100ng/ml)+ IL-2(5u/ml),并以MNCs单独培养作为空白对照组。37℃,5%CO2及饱和湿度的条件下培养。

  1.2.3  形态观察  双相倒置显微镜,每12h观察细胞形态1次。

  1.2.4  NKT细胞的含量及表型检测  吸取100μl培养的细胞,各加入20μl PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体,避光孵育15 min,加入0.5ml PBS,做双荧光检测,测定第7天和第14天TCR Vα24+ Vβ11+ NKT细胞含量及其他表型特征。

  1.3  统计学处理  采用SAS6.0统计软件作配对t检验

  2  结果

  2.1  脐血NKT细胞的扩增

  2.1.1  IL-2刺激单个核细胞中NKT的扩增  扩增后脐血TCR Vαβ+ NKT细胞占淋巴细胞的比例:第7天时,UCB-NKT为(0.29±0.09)%;第14天时,为(0.24±0.28)%。与MNCs单独培养组相比,脐血NKT细胞的扩增效率较原来差异无显著性(P>0.05)。见表1。

  2.1.2  α-Galcer和IL-2联合刺激单个核细胞中NKT的扩增  加用α-Galcer后,NKT的扩增效率有明显提高,占淋巴细胞的比例:第7天时,UCB-NKT为(24.48±4.19)%;第14天时为(12.15±2.02)%。尤其是培养到第7天的UCB-NKT是原来的(8.74±4.37)×102倍,与MNCs单独培养组和MNCs+ IL-2组相比,差异均有显著性(P<0.01)。见表1。 

  2.1.3  形态学观察  α-Galcer+ IL-2组的脐血NKT细胞培养至4~5天出现聚集现象,第7~8天时,有聚集团出现且多漂浮,增殖明显,细胞呈大圆形或椭圆形。2周左右,部分细胞变小、萎缩。随着培养时间的延长,细胞逐渐死亡。

  2.2  脐血NKT细胞的表型特征  选取TCR Vαβ+NKT细胞较多的第7天的UCB-NKT,发现脐血NKT细胞同时表达TCR Vα24和TCR Vβ11,而且后者的表达率远高于前者,在TCR Vβ11+的细胞中,CD161低表达。见图1~3。

  3  讨论
     
  已证实人类NKT细胞的数量下降或功能改变与一些自身免疫性疾病有关,如系统性红斑狼疮、硬皮病中,NKT细胞的数量均较正常人有明显减少[1~3]。因此,作为细胞免疫治疗的一种途径,在体外建立一种能大量扩增NKT细胞的方法,分析它的表型特征,对于今后的临床研究及诊断治疗,都具有一定的意义。
     
  本研究采用来源广泛的脐带血作为标本来源,利用NKT细胞可受非经典MHC-I 样分子CD1d的限制性递呈,特异性识别一些糖脂类抗原,如α-Galcer,在体外大量扩增。由于CD1d不仅表达在DC上,在NKT细胞的某一亚型,或在单个核细胞及B细胞上也有表达[4],所以即使在抗原递呈细胞(如DC)不参与的情况下,脐血的NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)仍有良好的扩增效率。实验表明,单用IL-2刺激的实验组中, NKT的扩增效率与对照组相比,均无明显的改变(P>0.05);而加用α-Galcer后,NKT的扩增效率有明显提高(P<0.01)。证实了IL-2虽为T细胞的增殖活化因子,但不具特异性,对NKT的扩增效果不明显;而α-Galcer确实有刺激NKT细胞扩增的作用,与文献报道一致。脐血中的NKT虽未成熟,但其本身因为已具备了与α-Galcer结合的互补配体,所以同样也表现出良好的扩增效果。

  现已证明,NKT细胞有一经典的表型特征,那就是它恒定表达TCR Vα24和TCRβ11,但本实验又对其作了其他表型的流式测定。结果发现,以脐血为来源的NKT 细胞除了特异性表达TCR Vα24和TCR Vβ11外,在所有TCR Vβ11阳性细胞中,大多不表达CD161。笔者推测,这可能是NKT的另一种亚型,而且脐血NKT的TCR Vβ11+的表达率远远高于TCR Vα24+,推测NKT细胞的表型表达可能与其本身的发育成熟度有关,脐血中的NKT因尚处于细胞生成早期阶段,大多尚未成熟,TCR Vβ11是其先行表达的表型之一。
     
  随着对NKT细胞的不断深入研究,体外有效扩增脐血NKT的方法建立为今后进一步临床研究奠定了一定的基础。但究竟其细胞表型与功能之间究竟存在着何种联系,还有待我们进一步探讨。

  【参考文献】

  1  Hammond KJ, Poulton LD, Palmisano LJ ,et al. alpha/beta-T cell receptor (TCR)+CD4-CD8- (NKT) thymocytes prevent insulin-dependent diabetes mellitus in nonobese diabetic (NOD)/Lt mice by the influence of interleukin (IL)-4 and/or IL-10.J Exp Med, 1998, 187:1047-1056.

  2  Wilson SB,Kent SC,Patton KT, et al. Extreme TH1 bias of invariant V alpha 24J alpha Q T cells in type 1 diabetes.Nature,1998,391(6663):177.

  3  Zeng D,Lewis D,Defbakhsh-Jones S,et al.Bone marrow NK1.1(-) and NK1.1(+) T cells reciprocally regulate acute graft-versus-host disease.J Exp Med,1999,189(7):1073.

  4  Ueda Y, Hagihara M, Gansuvd B, et al. The effects of alphaGalCer-induced TCRValpha24 Vbeta11(+) natural killer T cells on NK cell cytotoxicity in umbilical cord blood.Cancer Immunol Immunother, 2003, 52:625-631.

  基金项目:上海市卫生局青年科研基金资助项目(034y34)

  作者单位: 200051 上海,上海市血液中心血液工程研究室


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