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成人虹膜色素上皮细胞的培养

来源:INTERNET 作者:时境迁 戴虹 李毅斌 2005-8-9
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摘要: 【摘要】 目的 进一步地研究IPE的功能,及其在眼科疾病中发挥的作用,为将来的人自体色素上皮细胞移植奠定基础。方法 采用酶辅助的显微分离法对15只成人眼进行IPE的原代和传代培养,免疫组化鉴定细胞,并评价其部分生物学特性。结果 培养的成功率达85%,原代培养需10~20天,而传代培养需10~14天,分裂时间为5~11天,总......


    【摘要】 目的 进一步地研究IPE的功能,及其在眼科疾病中发挥的作用,为将来的人自体色素上皮细胞移植奠定基础。方法 采用酶辅助的显微分离法对15只成人眼进行IPE的原代和传代培养,免疫组化鉴定细胞,并评价其部分生物学特性。结果 培养的成功率达85%,原代培养需10~20天,而传代培养需10~14天,分裂时间为5~11天,总分裂次数为6~8代。免疫组化显示,培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白(AE1/AE3)和S-100抗原染色均为阳性,未见阴性染色细胞。结论 采用酶辅助的显微分离法培养的IPE细胞体系是一个高效纯化的细胞体系,可用于进一步地研究IPE的功能及其在眼科疾病中发挥的作用,以及将来的人自体色素上皮细胞移植。

关键词 成人 虹膜色素上皮细胞 体外 分离 培养

视网膜色素上皮细胞(RPE)的功能异常是许多视网膜疾病的病因之一,因此人们力图通过RPE的移植来治疗这些疾病。自从Gouras [1] 等首次报道将体外培养的人类RPE细胞成功地移植于猴的玻璃膜上之后,对同种异体RPE细胞的移植便广泛地开展起来。然而,虽然视网膜下腔被认为是“免疫特赦区”,但研究表明其并不能完全地逃脱免疫排斥反应 [2~4] 。因此,人们又把目光投向了自体色素上皮细胞的移植。

虹膜色素上皮细胞(IPE)与RPE在胚胎起源上具有同源性,在解剖上具有连续性,如果IPE具有相同或者相似的功能,那么就可以用IPE代替RPE来进行视网膜细胞移植。然而,虽然RPE的体外培养已经有20多年的历史,但是直到Hu等 [5] 在90年代初首次成功地对IPE成功地进行了分离和体外纯化培养,人们才对IPE的功能和IPE在一些眼科疾病中的作用 [6]有所认识。为了进一步地研究IPE的功能,及其在眼科疾病中的作用,为将来的人自体色素上皮细胞移植奠定细胞培养基础,我们进行了成人IPE细胞原代及传代培养的实验技术研究,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 成人IPE细胞的分离和原代培养 成人眼球由北京同仁医院眼库提供,采用酶辅助的显微分离法 [5] 对15只人眼IPE细胞进行分离,所有操作均在层流室(千级)内进行。

方法:于角膜缘处环行剪开巩膜全层,尽量保持色素膜组织完整,沿虹膜根部剪下虹膜置于35mm培养皿,后面朝上,皿内加入0.25%胰蛋白酶,37℃消化30min,加等量含有10%胎牛血清的F-12培养基(含有青、链霉素各100U/ml,谷氨酰胺2g/L)终止消化。取一支弯巴斯德吸管,火焰抛光后刮取IPE。将刮取的IPE收集于15ml离心管,1000rpm离心5min,弃去上清,轻轻振荡以便打散细胞,并用含有10%胎牛血清的F-12培养基重新悬浮IPE细胞,重复此过程1~2次,以洗去细胞悬液中的色素颗粒以及其它杂质。计数收集的细胞的量,将细胞接种于25cm 2培养瓶,每2~3个眼球的IPE接种1瓶,加入含有20%胎牛血清的F-12培养基,使培养瓶中的液体量达到5ml/瓶。将细胞置于5%CO 2 、95%O 2 、37℃下进行常规细胞贴壁培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态,细胞贴壁后每3~4天换液1次,至细胞接近融合时进行传代培养。

1.2 IPE的传代培养 弃去细胞培养液,用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次,0.25%胰蛋白酶37℃下消化5~10min,倒置显微镜下见细胞收缩变圆时加入等量含有10%胎牛血清的F-12培养基终止消化,收集细胞于15ml离心管,1000rpm离心5min,弃去上清,用含有10%胎牛血清的F-12培养其重新悬浮IPE细胞。血球计数板计数细胞量,1:2~3分种至25cm 2 培养瓶。用含有10%胎牛血清的F-12培养基补足培养瓶中的液体量,使之达到5ml/瓶。将细胞置于5%CO 2 、95%O 2 、37℃下进行常规细胞贴壁培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态,细胞贴壁后每3~4天换液1次,每10~14天传代1次。

1.3 体外培养成人IPE细胞的生物学性状

1.3.1 培养成功率 以细胞接种后贴壁生长至细胞融合为培养成功,培养成功瓶数与总接种瓶数之比即为培养成功率。

1.3.2 细胞生长曲线 取传2代IPE细胞,0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,加入20%胎牛血清的F-12培养基,接种于24孔板,每孔1×10 4 细胞,常规培养。每隔24h取3孔板,血球计数板计数,取平均数绘制细胞生长曲线。

1.3.3 分裂时间 分裂时间(doubling time,DT)=0.3T/log D,其中T为生长天数,D为生长倍数=收活细胞数/接种细胞数。

1.3.4 总分裂次数 总分裂次数(Population doubling,PD)=3.3log D

1.4 体外培养成人IPE细胞的鉴定 将生长近融合时的传2代细胞,0.25%胰蛋白酶消化,吹打成单细胞悬液,含胎牛血清的F-12培养基终止消化,接种于铺有22mm×22mm盖玻片的6孔板中,细胞数为1×10 5 /孔,培养3~4天后,弃去培养液,PBS刷洗2遍,95%乙醇固定,3%过氧化氢除去内源性酶,血清封闭后,分别以细胞角蛋白(AE1/AE3,1:50)和S-100(1:200)为一抗,S-ABC试剂盒进行免疫组化染色,AEC显色,光镜下观察,照相。

2 结果

2.1 原代细胞的培养 分离获得的成人IPE细胞呈黑色,圆形,细胞核轮廓不清,体积比猪IPE细胞略大,接种后以细胞团或者分散的单个细胞的形式沉积于培养瓶,IPE细胞接种后3~4天贴壁,贴壁后1~2天开始伸展,呈多边形,细胞核轮廓变清,呈空泡状,细胞核周围可见大量色素颗粒聚集。大部分伸展的IPE细胞能够进入生长期,这时可见核分裂相。贴壁后,经过10~20天的培养,IPE细胞生长融合。

2.2 传代细胞的培养 消化分散的IPE细胞小而圆,细胞仍为黑色。随着传代次数的增加,细胞内含有的色素越来越少,色泽较原代细胞明显变淡。生长的细胞可呈多边形的小细胞,或者呈梭形,类似成纤维细胞;亦有部分细胞呈静止状态,胞体巨大呈多边形,内含较多的黑色素。传代的IPE细胞接种后3~4h方伸展、贴壁。贴壁后,一般10~14天,细胞生长至融合,可再次传代。传代4~5次之后,可见部分IPE细胞衰老,胞体发出很多分枝的细突起,类似神经细胞的轴突。

2.3 体外培养IPE细胞的生物学性状

2.3.1 15只成人眼,共接种7瓶,6瓶生长至融合,进行传代培养,培养成功率为85.71%。

2.3.2 体外培养IPE细胞的生长曲线 由生长曲线来看,在本文的生长体系下,IPE细胞于接种后的第3天开始进入对数生长期,经过3~4天后,进入生长缓慢的平台期。见图1。

2.3.3 分裂时间为5~11天。

2.3.4 总分裂次数为6~8代。

2.4 免疫组化鉴定显示,培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白(AE1/AE3)和S-100抗原染色均为阳性,未见阴性染色细胞。见图2~4。

3 讨论

由于IPE细胞与下方的无色素上皮细胞及虹膜基质之间无Bruch’s膜相分离,而且IPE细胞与虹膜基质之间的连接以及IPE细胞之间的连接都较为牢固,因此其分离和纯化培养较难,直至Hu [5] 通过比较多种分离培养方法,明确酶辅助的显微分离法为最佳的分离方法,才真正实现了IPE细胞的高效纯化培养。其优势在于:既缩短了细胞在酶中的暴露时间,又减少了机械分离对细胞的损伤,将总体对细胞的损害减少到了最小。另外,成人的IPE细胞相对幼年动物以及人胚胎细胞相对衰老,培养起来具有更大的难度。

我们对成人IPE细胞进行了培养,培养的成功率达85%。生长曲线是观察细胞生长特性和规律的基本方法。由生长曲线来看,细胞于第3天进入对数生长期,经过3~4天的对数期生长,细胞进入平台期。实际细胞培养过程中,原代培养需10~20天,而传代培养需10~14天,分裂时间为5~11天,总分裂次数为6~8代。这说明,我们得到的是一个较为高效的细胞培养体系。

细胞角蛋白是上皮细胞的特异性标志,而S-100抗原是神经脊来源的标志。由于IPE细胞来源于神经外胚层,细胞角蛋白抗体和S-100抗原抗体染色均呈阳性,而虹膜黑色素细胞不是上皮细胞,其细胞角蛋白抗体为阴性,因此通过免疫组化可以将二者区分开来。本文培养的细胞的细胞角蛋白抗体和S-100抗原抗体的染色均为阳性,未见阴性细胞,证明我们成功地纯化培养了成人IPE细胞。

成人IPE细胞纯化培养的实现,为进一步研究IPE细胞的功能,IPE细胞在眼科疾病中的作用提供了可能,并为进行人的IPE细胞移植奠定了基础。

(本文图见封三) (略)

参考文献

1 Gouras P,Flood MT,et al. Transplantation of cultured human retinal epithelium to Bruch’s membrane of monkey’s eye. Invest Ophthalmol Vis Sci,1983,24:142.

2 Zhang XY,Bok D.Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci,1998,39(6):1021.

3 Crafoord S,Algvere PV,Kopp ED,et al. Cyclosporine treatment of RPE allog rafts in the rabbit subretinal space. Acta Ophtahlmol Scand,2000,78(2):122.

4 Crafoord S,Algvere PV,Seregard S,et al. Long-term out come of RPE allografts to the subretinal space of rabbits. Acta Ophtahlmol Scand,1999,77(3):247.

5 Hu DN,Rich R,et al. Isolation and culture of human iris pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1992,33:2443.

6 Hu DN,McCormick SA,Ritch R. Isolation and culture of iris pigment epithelium from iridectomy specimens of eyes with and without exfoliation syndrome. Arch Ophthalmol,1997,115(1):89-94

作者单位: 1 100730 卫生部北京医院

          2 北京同仁医院眼科中心,北京市眼科研究所


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