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肿瘤蛋白质组学研究的新进展

来源:INTERNET 作者:曾 亮 胡国斌 2005-6-15
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摘要: 【摘要】 随着蛋白质组研究策略及相关技术的逐渐完善,已越来越多地应用于生物医学领域,本文主要介绍蛋白质组学技术在肿瘤研究方面应用的新进展。 人类基因组计划(HGP)全基因组测序的完成,标志着后基因组时代的到来,其主要任务是分析细胞全部蛋白质的结构、功能和相互作用,即蛋白质组学。恶性肿瘤是危害人类的主要......


  【摘要】  随着蛋白质组研究策略及相关技术的逐渐完善,已越来越多地应用于生物医学领域,本文主要介绍蛋白质组学技术在肿瘤研究方面应用的新进展。

    人类基因组计划(HGP)全基因组测序的完成,标志着后基因组时代的到来,其主要任务是分析细胞全部蛋白质的结构、功能和相互作用,即蛋白质组学。恶性肿瘤是危害人类的主要疾病之一,但其发生发展机制仍不清楚,诊断、治疗效果也不理想,而蛋白质组学方法可望为肿瘤发生机制的研究和防治带来新的突破,本文将介绍这一领域的进展。

    1 蛋白质组学技术概述

    蛋白质是细胞的功能产物,一个基因组所表达的全部蛋白质即为蛋白质组,可反映细胞当前功能状态,除了基因组成可决定蛋白表达,细胞及环境因素均可通过影响基因而调控蛋白表达,也可直接影响蛋白表达。蛋白质的表达或功能在从转录到翻译后过程中均受到调节,故mRNA表达水平不能代表细胞中活化蛋白量,由于转录产物能由多种方式修饰而产生不同类型蛋白,并且翻译后修饰对蛋白质的功能和活性有重要作用。经二维电泳分离的蛋白亚型常是翻译后蛋白调节的结果,蛋白分析技术的进展最终将使全蛋白质组分析成为可能,并将对细胞功能有更深入了解 [1,2] 。蛋白质组学技术分为分离技术和鉴定技术。蛋白质分离的基本技术是二维电泳,一维分离是以蛋白电荷差异为基础,二维分离以分子量不同为基础。分离后的胶块在银染色、放射或荧光标记后通常可显示蛋白点,对有兴趣的蛋白点可进一步鉴定。目前蛋白质鉴定的主要技术是质谱技术。蛋白或多肽可由液态被电喷雾离子化或由固态被基质辅助激光解吸离子化-时间飞行质谱仪(Matrix-assisted desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI MS),离子的质量可由相应分析仪精确测定,如时间飞行分析仪(TOF)可测定离子由发出点到检测器(MALDI-TOF)的时间。也可用胰酶将切除的蛋白点消化为多肽混合物,多肽的质量可由质谱测定而产生肽质指纹图,在与数据库中理论上蛋白质消化后所预测的肽质量比较,可确认该蛋白。此外,表面增强激光解吸/离子化(Surface-enhanced Laser Desorption/Ionization,SELDI)与LC-MS,二维电泳结合质谱、ELISA等方法比较,具有可重复性好、敏感性高、易于操作、快速、经济的优点。SELDI也可检测出传统方法难以检测出的蛋白,如已使用SELDI从前列腺癌患者的血清中成功确定了前列腺特异性膜抗原(PSMA)。蛋白质组技术结合高通量方法需要强大的数据分析工具。蛋白质生物信息学指对质谱数据的分析、储存、管理、搜寻及回顾,借助分析蛋白分离结果的软件包,以及因特网上的资源,不仅可识别蛋白,也可对描述其基本的理化性质,并预测潜在的翻译后调节和三维结构,蛋白质组研究中生物信息学的核心是蛋白质和二维电泳数据库,其中SWISS-PROT最具代表性,随着蛋白质组研究的推广,更多的数据库建立起来 [3,4] 。功能蛋白质微阵列将是蛋白质组学的下一个挑战,它可检测极少量标本中成千上万的基因。但有不少问题亟待解决,因为蛋白质在一般情况下易于变性,蛋白质难以吸附在芯片表面,并且还没有类似PCR的方法来扩增微量蛋白质,并很难通过单一蛋白质芯片来分离这些蛋白质复合物。一些蛋白质和肽阵列已用于检测某种蛋白及其修饰后形式。也有应用高通量芯片研究蛋白-蛋白,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA相互作用。由于肽是酶的底物,肽芯片可用于酶学研究。此外,由于组织样本中细胞类型的多样性而造成分析复杂化。一些辅助技术如激光捕获微(LCM)切割现已成功用于辨别基因差异,预计其在蛋白分析中也有重要价值。VON等用LCM系统研究头颈恶性肿瘤中瘤组织和正常组织以及微切割的黑色素瘤以显示差异表达的蛋白,结果表明在比较来源于复杂的组织裂解物的蛋白表达谱中,它能较好显示不同样本间蛋白表达差异 [5] 。其它一些技术,如亲和层析法、免疫荧光等,也与蛋白质组技术结合使用,其目的主要是增强对样本的分辨,以及对蛋白的鉴定结果进行验证。

    2 肿瘤蛋白质组学研究的进展

    全基因组表达分析已逐渐从实验室的基础研究过渡到大规模的临床试验。主要体现在基因组学和蛋白质组学技术用于提高肿瘤的诊断和治疗 [6] 。应用DNA芯片技术实现了通过全基因组分析检测癌变过程中基因异常活化或改变,但一些在肿瘤发生、诊断、预后中起重要作用的改变可能与分子水平异常无关,而与一些蛋白的过表达和翻译后修饰有关,这预示着蛋白质组技术将是最终阐明癌症的本质及提供有效防治手段的最有力的手段。目前该领域主要目标是发现新的肿瘤标志物以及应用于癌症发生发展机制研究。

    2.1 蛋白质组学方法应用于肿瘤发生机制的研究

    2.1.1 病毒感染介导肿瘤发生的蛋白质组学研究 已有证据显示病毒与人类多种肿瘤发生密切相关,但其机制有待进一步阐明。丙型肝炎病毒(HBV)感染与肝细胞性肝癌(HCC)密切相关,通过蛋白质组方法比较诊断为HCC和未有HCC的动物模型发现,其中HCC组有高水平的serum-asso-ciated core alpha-1,6-linked fucose、高尔基蛋白73(GP73)。丙型肝炎病毒(HCV)也在肝癌发生中起着重要作用。通过建立来自HCV感染患者的肝癌组织和非癌肝组织的二维电泳蛋白质表达谱,发现50%以上病例中,11种蛋白在肝癌组织中表达降低,对其中8种显著表达差异的蛋白质进行了质谱分析,表明这些蛋白的改变在肝癌中具有特征性 [7] 。人乳头瘤病毒与宫颈癌的发生密切相关。同时用蛋白质组方法和DNA微阵列技术比较HPV阴性的宫颈癌细胞株C33A以及转染了HPV16型编码的癌基因E7的C33A(C33A/E7),发现在C33A/E7中蛋白质disulfide isomerase A3、integrase interactor1protein、生长抑制蛋白、glutathione S-transferase P和vav原癌基因下调,而热休克蛋白60kDa1、Ku70结合蛋白、alpha enolase、26S蛋白酶体亚单位上调。而DNA微阵列结果发现E7癌基因诱导IL-12R beta1、细胞色素C和肿瘤坏死因子受体Ⅱ。这些提示E7通过抑制或诱导细胞信号分子、细胞周期调节因子和chaperones来逃避免疫监视 [8] 。

    2.1.2 蛋白质组技术应用于肿瘤发生和发展机制的研究 蛋白质组学技术也广泛用于肿瘤发生和演进的机制研究。在胃癌转移和发生机制的研究中,使用经N-methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine(MNNG)口服诱导Wistar鼠致胃癌的动物模型,对正常胃组织、胃癌组织以及转移灶标本进行二维电泳和MALDI-TOF质谱分析,发现25种差异表达蛋白,并用免疫组织化学证实HSP27在人胃癌组织呈过表达状态。动物模型与蛋白质组分析的结合能更好显示癌变及转移发生中的分子改变 [9] 。甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)参与肝癌的发生并认为是诊断和预后标志物。为了研究与AFP相互作用的蛋白质,应用荧光二维差异电泳比较9种表达AFP的肝癌细胞株和7种不表达AFP的肝癌细胞株的蛋白质表达谱发现11种差异表达蛋白,在AFP表达细胞中6种呈上调,5种呈下调。这11种蛋白分为4类:细胞凋亡、糖代谢、细胞骨架组成、翻译,这些与AFP相关的蛋白对AFP阳性肝癌细胞的生物学特征方面具有重要意义 [10] 。蛋白质组用于癌基因相关信号通路的研究也具有优势。p53突变出现在50%以上的人类肿瘤中。使用AACT(amino acid-coded mass tagging)辅助质谱比较结直肠癌细胞株DLD-1和转染诱导型p53的DLD-1.p53,发现被p53调节的蛋白包括细胞周期、p53结合、蛋白伴侣、应激、抗氧化酶、糖代谢等,提示p53诱导的凋亡介导糖代谢,能量依赖性、氧化应激介导、细胞器间相互作用介导的多条通路活化 [11] 。为了研究Ras介导卵巢癌上皮细胞恶性转化的分子机制,建立SV40T/t抗原及人端粒酶催化亚单位永生化的卵巢上皮细胞株和癌基因ras转化的卵巢上皮细胞株的二维电泳图谱,用肽质指纹筛选出30多个表达差异的蛋白质点,其中ras信号通路明显增加细胞的抗氧化能力,特别在线粒体,抗氧化能力的提高可保护瘤细胞免受活性氧的损害,可能是肿瘤细胞抗凋亡的重要机制 [12] 。抑癌基因Smad4在50%的胰腺癌中缺失或突变。用稳定RNA干扰建立Smad4敲除(S4KD)胰腺癌细胞株,Smad4蛋白表达和TGF-beta-Smad4通路均受到抑制。进行蛋白质组学研究发现上调的5种蛋白和下调的7种蛋白,其中10种蛋白为TGF-beta新的靶蛋白,涉及细胞骨架调节、细胞周期、氧化应激等方面 [13] 。

    2.2 临床蛋白质组学与肿瘤的诊治 临床蛋白质组学是指蛋白质组学技术应用于临床研究,可同时且广泛检测出在疾病状态和生理状态下大量蛋白质的变化以解决临床研究中的难题,目前蛋白质组学分析已广泛用于肿瘤、心血管疾病、器官移植及药代动力学的研究。

    2.2.1 蛋白质组技术在肿瘤生物标志物研究中的应用 癌症蛋白质组学近年来取得了许多新进展,但这些进展并没有降低癌症的死亡率,一个重要原因是缺乏敏感和特异的标志物而不能在人群中进行疾病普查,蛋白质组学技术的出现可以快速有效地发现在各种疾病状态下蛋白质/多肽的表达状态而确定新的肿瘤标志物。生物标志物是能显示机体生理状态和疾病状态的生物分子,可以提供疾病的早期表现,监测疾病进展并在人群中进行筛查。标志物的发现开始于基因组研究,而将在功能基因组或蛋白质组研究中得到进一步发展。生物标志物的来源较为广泛,如血液、组织液及组织 [14] 。血清蛋白质组学是生物标志物研究的重要方面。回顾性对246例进行前列腺癌根治术的男性患者以及99例良性前列腺疾病患者的血清进行蛋白芯片及质谱分析后发现一组蛋白PC-1、PC-2、PC-3,其联合检测敏感性高于前列腺特异性抗原。为了发现用于鼻咽癌复发诊断的血清标志物,通过蛋白质芯片分析发现两种标志物血清淀粉样蛋白(serum amyloid A,SAA)蛋白的两种亚型,在鼻咽癌病例中显著增高,并且与复发及化疗反应有关。从荷瘤鼠的血浆中发现肿瘤相关蛋白。5种人类癌细胞株(胃、鼻咽、肠、口腔、脑)由皮下接种至裸鼠,以注射PBS作为对照,1个月后,取实验组裸鼠的血浆进行蛋白质组分析,在荷瘤鼠的血浆中发现几种急性期蛋白(acute phase proteins,APPs)呈过表达,如hap-toglobin。而血清SAA仅存于在胃癌细胞株SC-M1的荷瘤鼠的血浆,可能作为胃癌检测的标志物 [15,16] 胰腺癌的生存率长期没有提高,一个重要原因是缺乏早期诊断方法。应用蛋白质组学方法研究胰腺癌细胞/正常细胞、胰液及血清以寻找胰腺癌早期检测生物标志物是一种有效方法。胰液蛋白质组可能用于胰腺癌的诊断,胰液首先经单相电泳进行分离,然后经LC-MS/MS分析,发现170种蛋白包括已知的胰腺肿瘤标志物如CEA,MUC1,以及在胰腺癌中过度表达的蛋白如肝癌-肠-胰腺/胰腺炎相关蛋白(HIP/PAP)和lipocalin2,此外也发现一些先前未发现存在于胰液中的蛋白如tumor rejection antigen(pg96)和azurocidin。其中一种与HIP/PAP相似的蛋白PAP-2可能作为胰腺癌的标志物 [17,18] 。肿瘤间质液(tumor interstitial fluid,TIF)是肿瘤标志物的另一重要来源,如灌洗乳腺肿瘤间质。收集新鲜切除的乳腺癌标本的TIF进行二维电泳和质谱分析,显示有多于1000个蛋白点,其中发现267种蛋白产物,与细胞增殖、侵袭和转移、血管生成、能量代谢、氧化应激、肌动蛋白细胞骨架聚合体等相关,TIF中也含有一些常见的血清蛋白。TIF反映了组织的生理和病理状态,可从其中得到诊断性生物标志物以及用于肿瘤干预的靶蛋白 [19] 。脑脊液(CSF)在后基因组时代已从新被认识到是各种疾病生物标志物的重要来源,用二维电泳结合MALDI-TOF-MS分析在原发性脑瘤患者的脑脊液样本中发现了两种候选的肿瘤相关蛋白N-myc癌基因和低分子量caldesmon(l-CaD),在配对的脑瘤组织切片中N-myc和l-CaD分别与瘤细胞核和血管相关,可能作为标志物、预后和化疗反应性的检测指标 [20] 。尽管体液蛋白质组研究已开展,但由于存在于体液中的各种蛋白质极其量少,目前的蛋白质组技术还不能达到理想的分离和鉴别效果。组织蛋白质组学也是标志物筛选的重要方面 [21] 。有报道应用含有378个单克隆抗体的蛋白质阵列分析分析乳腺癌和癌旁正常组织,发现一系列蛋白表达差异,如在癌组织中casein kinase Ie,p53,annexin XI,CDC25C,eIF-4E、MAP kinase7表达上调,而多功能调节因子14-3-3e表达下调。此外蛋白质组学方法也应用于多种恶性肿瘤组织标志物的研究,并得到一些重要结果。

    2.2.2 蛋白质组学与肿瘤治疗 目前蛋白质组技术在肿瘤治疗方面的应用主要在寻找能反映治疗效果的标志物、化疗药物及放射治疗的作用机制等方面。在乳腺癌的疗中,同样肿瘤类型的患者对标准治疗方案效果差别很大,临床蛋白质组学可解决这一方面的问题,最终目的是患者能得到个性化的治疗。比较乳腺癌患者化疗前后血浆中蛋白质组的改变发现在化疗期间血浆中变化较少,仅发现单个化疗诱导的蛋白峰以及区分乳腺癌与正常女性血浆的5个蛋白峰,这些峰所代表的蛋白可能是手术后微转移早存在的候选标志物。乳腺癌治疗中抗雌激素抗性的产生是激素治疗的一大障碍,人乳腺癌细胞株T47D及其衍生的抗雌激素治疗不敏感的T47D-r,38种蛋白在两种细胞株中差异地上调或下调,结合mRNA差异表达显示的19种上调或下调的分子发现11种蛋白的相应mRNA水平无差异,8种蛋白与其mRNA水平呈相反的变化趋势 [22,23] 。不同直肠癌病例表现出不同的放疗敏感性,为了识别放疗抗性相关蛋白,收集放疗前的直肠癌活检标本,这些病例分别表现为对放射治疗的敏感及部分敏感。经蛋白质组方法分析这些标本发现在放射敏感肿瘤中的44个蛋白,其中与放射反应性显著相关的蛋白有热休克蛋白42、beta-tubu-lin、annexin等,或与放射敏感性相关的有keratin typeⅠ、DNA修复蛋白等 [24] 。全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)抑制癌细胞生长,诱导分化及细胞凋亡,包括急性早幼粒细胞性白血病(APL)。为了研究在APL中ATRA诱导的生长抑制和细胞分化。用蛋白质组方法筛选ATRA作用下59种差异表达的蛋白质,提示在APL中ATRA诱导的生长抑制过程中,多条翻译后抑制通路被激活 [25] 。综上所述,目前肿瘤蛋白质组研究已在多种肿瘤的诊治中展开,其结果一方面有助于肿瘤发生发展机制的阐明以及发现新的标志物,另一方面相应数据库的建立是全蛋白质组数据库的重要组成;由于肿瘤组织来源复杂性、肿瘤异质性等决定肿瘤相关蛋白的多样性、复杂性,可预计此工作将任重道远。

    3 问题及展望

    相对于基因组研究,肿瘤蛋白质组研究还处于起步阶段,其中最主要的问题是蛋白质组技术上的不足。低丰度蛋白难以检测,但没有一种类似于PCR扩增的方法能将蛋白质扩增。而病理学家期待2D-PAGE能用于甲醛固定的存档组织,但由于甲醛固定使蛋白发生交联而不溶,因此不能用于蛋白质组研究。目前蛋白质组研究结果与相应基因组结果吻合少,一是由于基因翻译后修饰所致,而对一些低丰度蛋白不能分辨也是原因。许多研究都以增进蛋白质组技术效率为目的,特别是其自动化,样本通量及敏感性。由于2D-PAGE是目前蛋白质分离的主要方式,故建 立将各分离点从2D-Gel中提取的自动化系统成为当前发展的焦点。总之,肿瘤蛋白质组学的目的在于加深对肿瘤发生机制的理解并发现新的肿瘤早期检测标志物及治疗的靶蛋白。蛋白质组学技术的完善最终将克服这些障碍,最终将成为恶性肿瘤以至人类其它疾病机制阐明和防治中的有力武器。

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    作者单位:410006湖南长沙湖南省肿瘤医院病理科 


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