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一种新兴的生物材料—PEG/PBT的急性毒性试验研究

来源:INTERNET 作者:徐瑞兴 陈双玲 杨 华 杨 丽 李幼忱 马俊杰 刘 杰 2005-6-9
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摘要: 【摘要】 目的 检测聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEG/PBT)嵌段共聚物的急性毒性,为PEG/PBT在组织工程中应用奠定基础。 方法 (1)按照国际标准化组织标准要求制备PEG/PBT浸提液。(2)小鼠急性全身毒性试验。(3)皮肤原发刺激试验。...


  【摘要】 目的  检测聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEG/PBT)嵌段共聚物的急性毒性,为PEG/PBT在组织工程中应用奠定基础。 方法  (1)按照国际标准化组织标准要求制备PEG/PBT浸提液;(2)小鼠急性全身毒性试验;(3)皮肤原发刺激试验;(4)MTT法检测细胞毒性。 结果  急性毒性实验阴性。 结论  提示PEG/PBT具有成为组织工程支架的潜在应用价值。

    Acute toxicity research of PEG/PBT———A new biologic material

    Xu Ruixing,Chen Shuangling,Yang Hua,et al.

    Capital University of Medicine Science,Beijing100054.

    【Abstract】 Objective To evaluate the acute toxicity of a new biologic material named PEG/PBT and prepare for its application in tissue engineering.Methods (1)Saturation liquid was made according to ISO request;(2)A-cute toxicity test of mouse;(3)Skin primary stimulus test;(4)MTT test.Results All of the results are negative. Conclusion The material could be applied in the research of tissue engineering.

    【Key words】 PEG/PBT acute toxicity tissue engineering

    聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEG/PBT)嵌段共聚物,具有降解产物酸性低,生物相容性好,不易引起受体组织炎症反应,性能优良可调、价廉易得等优点。因此,PEG/PBT作为一种新兴的生物材料,在骨、软骨、皮肤、鼓膜组织工程和药物缓释载体方面的应用进行了大量研究,取得了一批阶段性的成果,并有部分产品进入临床。本研究以自行合成的PEG/PBT作为研究对象,按照国际标准化组织标准要求制备PEG/PBT材料浸提液,进行急性全身毒性试验、皮肤原发刺激试验、细胞毒性试验,综合分析评价其生物相容性。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 PEG/PBT的制备 由本课题组自行设计并合成,采用熔融缩聚法合成,采用NMR、IR、DSC及力学性能测试等方法对材料结构及性能进行表征,结果表明PEG/PBT共聚物是一类性能良好、易于水解或热降解的聚醚酯弹性体,随着组成中PEG含量的增加,特性粘度及形变量增加,而弹性模量、抗拉强度降低,通过调节共聚物中两种组分的含量可方便地调节其机械强度 [1~3] 。

    1.1.2 动物 昆明种小白鼠及家兔购自军事医学科学院动物中心。

    1.1.3 细胞株 L929成纤维细胞细胞系。

    1.2 方法

    1.2.1 生物材料试样浸提液制备 已消毒包装的PEG/PBT,无菌条件下采用生理盐水浸提(试样表面积/浸体介质=3cm 2 /ml),37℃,120h,用于急性全身毒性试验;相同条件下采用DMEM培养液浸提,用于L929细胞毒性试验。

    1.2.2 小鼠急性毒性试验 体重18g左右的昆明种小白鼠30只,随机分为PEG/PBT组、生理盐水注射组和0.64%苯酚注射组,每组10只。分别作为试验组、阴性对照组和阳性对照组,尾静脉注射0.5ml/只,分别于注射后1h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、1w称重,每天观察机体反应,记录结果。

    1.2.3 皮肤原发刺激试验 制备PEG/PBT膜,大小为2.5cm×2.5cm/块。体重2.0~2.5kg的新西兰大白兔,随机分为3组,每组6只,背部两侧斑贴区备皮。PEG/PBT、5%甲醛0.5ml浸泡的滤纸块、生理盐水0.5ml浸泡的滤纸块,剪成2.5cm×2.5cm大小,分别作为试验组、阳性对照组、阴性对照组。大白兔完整和损伤皮肤各贴一块材料,24h后去除,去除后1、24、48及72h观察皮肤反应并记分。记分标准主要根据红斑和水肿的严重程度:0分为无刺激;≤1.9分为轻度刺激;2.0~4.9分为中度刺激;5.0~8.0为强刺激。皮肤刺激试验反应记分标准见表1。

    表1 皮肤刺激试验反应记分标准 (略)

    1.2.4 L929细胞毒性试验 采用四唑盐(MTT)比色法 [4] :用96孔板培养L929细胞,其细胞浓度为5×10 3 /ml,加入PEG/PBT的DMEM浸提液(浸提原液100%、50%、25%、10%、1%)培养。分别于24h及48h,经5mg/ml MTT和DM-SO处理后,用酶联仪(BIO-RAD450型)在490nm波长测其吸光度值,取平均值。计算RAR,根据表2进行细胞毒性分析。RAR(%)=试样A值-空白A值/阴性A值-空白A值

    2 结果

    2.1 急性毒性试验 阳性对照苯酚组,全组在注射后即刻发生全身剧烈抽搐,其中4只在持续抽搐半小时后死亡。PEG/PBT浸提液注射后1h,小鼠无异常反应。第1~7天体重均呈增长趋势,未发现死亡和中毒反应,与阴性对照生理盐水组无差别,表明该材料在急性全身毒性试验中呈阴性反应。其体重变化见表3。

    表2 计算RAR和细胞毒性分级(略)

    表3 PEG/PBT急性毒性实验小鼠体重变化 组别 注射后小鼠体重变化(略)

    2.2 皮肤原发刺激试验 无论是破损皮肤或完整皮肤,阳性对照组在72h内,最高可达到3分,而阴性对照组及实验组均未见到明显的红斑和水肿,呈阴性反应。具体结果见表4、图1及图2。

    表4 PEG/PET的皮肤原发刺激试验结果(略)

   
    图1 皮肤原发刺激反应阳性:破损皮肤,阳性对照组,24h(略)

    图2 皮肤原发刺激反应阴性:(略)

    3 讨论

    以可降解高分子材料作为组织工程支架是近年来生物学、材料学、医学等众多领域的研究热点。与几类常见的可降解高分子材料如聚丙交酯(PLLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)及其共聚物,及聚酸酐(PCPP)、聚假氨基酸等相比,聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEG/PBT)嵌段共聚物,具有降解产物酸性低,生物相容性好,不易引起受体组织炎症反应,性能优良可调、价廉易得等优点。荷兰的Iso-tis植入材料公司10年前将其商业化,取名PolyActive(r),并就这类材料在骨、软骨、皮肤、鼓膜组织工程和药物缓释载体方面的应用进行了大量研究,取得了一批阶段性的成果,

    表5 PEG/PBT细胞毒性试验结果浸提浓度 吸光度值细胞增殖率(略)

    并有部分产品进入临床。Fakirov S于1990年报道了PEG/PBT的合成,但其当时主要目的在于研究这类聚醚酯弹性体的结构和物理机械性能,合成中所用的苯胺类抗氧剂本身即为致癌物质,不能用于生物降解材料 [5~7] 。国内自80年代以来,吴美琰等合成了以PBT为硬段、聚四氢呋喃(PT-MG)为软段的聚醚酯弹性体),陈传福等研究了该共聚物的血液相容性;王身国等人合成并研究了以聚对苯二甲酸乙二酯(PET)为硬段、PEG与PTMG为软段聚醚酯的血液相容性;罗筱烈等合成了PET/PEG共聚物、研究了其组成的不均一性,并通过物理掺杂LiClO 4 及化学分子改性,获得了具有较高电导率的高分子阳离子导体,但有关PEG/PBT共聚物的合成以及作为生物可降解材料的研究国内还未见报道 [1~3] 。本研究利用熔融缩聚法合成了一系列具有不同链段结构的PEG/PBT嵌段共聚物,用NMR、IR、DSC及力学性能测试等方法对材料结构及性能进行表征,结果表明PEG/PBT共聚物是一类性能良好、易于水解或热降解的聚醚酯弹性体,随着组成中PEG含量的增加,特性粘度及形变量增加,而弹性模量、抗拉强度降低,通过调节共聚物中两种组分的含量可方便地调节其机械强度等。当硬段长度一定,随着高分子链中软段长度的增加,软硬段相容性减小,软段玻璃化转变温度降低,而硬段玻璃化转变温度变化不大,特性粘度、断裂延伸率增加,弹性模量、断裂强度及屈服强度降低。随着组成中软段分子量的增加,硬段长度相应增加,软硬段相容性减小,软段玻璃化转变温度降低,而硬段玻璃化转变温度变化不大,特性粘度、形变量、抗拉强度增加,弹性模量变化不大。以上先期结果表明,采用该种方法合成的共聚物,满足成为组织工程支架的物理和化学条件。本试验采用急性毒性试验、皮肤原发刺激试验及细胞毒性试验测试了PEG/PBT的急性毒性,结果表明从整体至细胞水平,该人工合成材料的生物相容性较好,具备开发为组织工程支架的潜在价值。

    参考文献

    1 张勇,张爱英,冯增国,等.聚乙二醇共聚对苯二甲酸丁二醇酯的合成及在生物材料中的应用.化学通报,2002,65(5):304-311.

    2 张勇,张爱英,冯增国,等.聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯弹性体的合成与表征.高分子学报,2002,(2):167-172.

    3 张勇,叶玲,冯增国,等.相同软硬段质量含量配比聚醚弹性体PEG/PBT的结构与表征.高等学校化学学报,2002,23(10):1982 -1987.

    4 司徒镇强,吴军正.细胞培养,西安:世界图书出版社,1994,186-187.

    5 Liu Q,de Wijn-JR,van-Blitterswijk CA.Nano-apatite/polymer composites:mechanical and physicochemical stics.Biomateri-als,1997,18(19):1263-1270.

    6 Liu Q,de Wijn JR,van Blitterswijk CA.Composite biomaterials with chemical bonding between hydroxyapatite filler particles and PEG/PBT copolymer matrix.J Biomed Mater Res,1998;40(3):490-497.

    7 Bezemer JM,Grijpma DW,Dijkstra PJ,et al.Control of protein delivery from amphiphilic poly(ether ester)multiblock copolymers by varying their water content using emulsification techniques.J Control Release,2000May15;66(2-3):307-320.

    基金项目:北京市教委科技发展计划资助项目(00KJ-107)
    作者单位:100054北京首都医科大学
    100850北京军事医学科学院放射医学研究所


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