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HPLC法测定葛根素葡萄糖注射液的含量和有关物质

来源:中华中西医杂志 作者:朱佳丽,赵沈娟△,杨玉琴,陈琴华,杨 敏 2011-6-29

摘要: 【摘要】 目的 建立HPLC法测定葛根素葡萄糖注射液的含量和有关物质。0ml/min。结果 葛根素在0。08878mg/ml范围内线性关系良好,平均回收率100。...


【摘要】  目的 建立HPLC法测定葛根素葡萄糖注射液的含量和有关物质。方法 采用Agilent Eclipse XDB- C18柱,甲醇-0.1%枸橼酸溶液(25:75)为流动相;检测波长为250nm;流速为1.0ml/min;柱温为30℃。结果 葛根素在0.02466~0.08878mg/ml范围内线性关系良好,平均回收率100.8%,RSD%为0.61%。结论 本方法灵敏迅速,准确可靠,可用于葛根素葡萄糖注射液的质量控制。

【关键词】  葛根素;HPLC;含量测定;有关物质

 【Abstract】 Objective To study a new method for determination content and related compounds of puerarin and glucose injection by HPLC.Methods Separation was carried out on an Agilent Eclipse XDB-C18 column using methanol- 0.1% citric acid solution (25:75) at detection wavelength 250nm. The flow rate was 1.0ml/min and column temperature was 30℃.Results The linear range of puerarin concentration was from 0.02466 to 0.08878 mg/ml ,the average recovery of sample was 100.8% and RSD was 0.61%.Conclusion This method is sensitive and accurate with good repeatability and suitable for the quality control of Puerarin and Glucose Injection.

  【Key words】 puerarin; HPLC; content determination; related compounds

  葛根素葡萄糖注射液是以葛根总黄酮为主要原料配制而成的注射液,其主要活性成分为葛根素,临床上用以治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜中央动脉阻塞。本文采用HPLC法测定葛根素葡萄糖注射液的含量及有关物质,结果准确可靠,辅料及降解物等不干扰主药测定。

  1 仪器与试药

  瑞士梅特勒XS205电子天平;美国安捷伦公司Agilent 1200高效液相色谱仪;Agilent Eclipse XDB- C18色谱柱(15cm×4.6mm,5μ);药物制剂国家工程研究中心DC-50E低温光照仪;上海建恒仪器有限公司SDH-01低温恒温恒湿箱;葛根素对照品(批号:110752-200912,含量:96.0%),购自中国药品生物制品检定所;葛根素葡萄糖注射液(批号:10011701、10011801、10011802,规格:100ml: 葛根素0.2g与葡萄糖5.0g),扬子江药业集团有限公司生产;配制流动相用甲醇为色谱纯,水为超纯水,其余化试均为分析纯。

  2 方法与结果

  2.1 含量测定

  2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-0.1%枸橼酸溶液(25:75)为流动相;检测波长为250nm;流速为1.0ml/min;柱温为30℃;进样量为20μl;理论板数按葛根素峰计算为6001。

  2.1.2 供试品溶液制备

  取本品,精密量取10ml,置100ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀;精密量取5ml,置20ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,制成1ml中含葛根素0.05mg的溶液,作为供试品溶液。

  2.1.3 对照贮备液制备

  取葛根素对照品51.38mg,置25ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,制成1ml中含1.9730mg的溶液。

  2.1.4 阴性对照与空白干扰试验

  取按处方制法制得缺葛根素的阴性对照适量,按供试品溶液制备法同法制得阴性对照液。取阴性对照液流动相(空白溶剂)与供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。由阴性对照色谱图与空白溶剂色谱图可知:在葛根素主峰相对应的位置无色谱峰出现,证明阴性对照与空白溶剂不干扰本品的含量测定。结果见图1。图1 葛根素葡萄糖注射液HPLC色谱图A 空白溶剂图 B 阴性对照溶液图 C 供试品溶液图 1 葛根素

  2.1.5 线性关系考察

  精密量取对照储备液5.0ml,置20ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀;分别量取0.5,0.8,1.0,1.2,1.5,1.8ml,分别置10ml量瓶中,分别加流动相稀释至刻度,摇匀,制成浓度为50%,80%,100%,120%,150%,180%的对照溶液。按上述色谱条件分别进样20μl,测定峰面积,以对照浓度X(mg/ml)为横坐标,葛根素峰面积Y为纵坐标进行线性回归,得回归方程:Y=6.62653e-010X-0.000392270,r=0.9999,结果表明葛根素在0.02466~0.08878mg/ml范围内线性关系良好。

  2.1.6 精密度试验

  取浓度为100%的对照溶液,按上述色谱条件分别连续进样6次,测定峰面积,计算对照品峰面积的RSD为0.03%,表明仪器的进样精密度良好。

  2.1.7 重复性试验

  取本品(批号:10011701),分别制备6份供试品溶液,按上述色谱条件分析,记录各色谱图,计算测得葛根素的平均含量为0.9592mg/ml,RSD为0.14%,表明方法的重复性良好。

  2.1.8 稳定性试验

  取上述供试品溶液,在室温放置,分别于0、2、4、6、8、10、12h,按上述色谱条件分析,记录色谱图,测得峰面积的RSD为0.11%。说明本品的含量测定溶液在12h内稳定。

  2.1.9 回收率试验

  取已知葛根素含量(批号:10011701,含量:0.9592mg/ml)的样品,精密量取2ml,置20ml量瓶中,分别精密加入1.9730mg/ml的对照贮备液1.0ml,照2.1.2项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件分析,测定峰面积,计算平均回收率为100.8%,RSD为0.61%,结果表明方法的准确性良好。

  2.2 有关物质

  2.2.1 测定方法

  取本品5ml,置25ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,制成1ml中含葛根素0.4mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取3ml,置100ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,制成1ml中含葛根素12μg的溶液,作为对照溶液。除流动相按下表1,进行梯度洗脱外,其余色谱条件参照含量测定项下。表1 有关物质的流动相梯度程序

  2.2.2 专属性试验

  本品经高温、高湿、酸、碱、光照和氧化破坏试验。结果表明,经高温、高湿、酸、碱、光照和氧化破坏后产生的杂质峰能与主峰基线分离。

  2.2.3 定量限与检测限试验

  取对照溶液,逐步稀释后进样20μl,待主峰峰高为基线噪音10倍时确定定量限为0.03ng,主峰峰高为基线噪音3倍时确定检测限为0.006ng。

  2.2.4 溶液稳定性试验

  取供试品溶液,在室温放置,分别于0、2、4、6、8、10、12h,按上述色谱条件分析,记录色谱图,单个杂质的RSD为2.28%,杂质总和的RSD为2.17%。说明本品的有关物质检查溶液在12h内是稳定的。

  2.3 样品的测定

  2.3.1 含量测定

  取对照溶液、供试品溶液分别进样,按外标法以峰面积计算3批样品的含量分别为95.92%、95.63%和95.82%。

  2.3.2 有关物质测定

  分别取对照溶液、供试品溶液进样测定,调节检测器灵敏度,按主成分自身对照法计算3批样品的有关物质,单个杂质分别为0.62%、0.60%、0.57%;杂质总和分别为1.57%、1.48%和1.46%。

  3 讨论

  3.1 原质量标准[1]

  有关物质与含量测定的流动相均为甲醇-0.1%枸橼酸溶液(25:75)的等度洗脱,有关物质色图谱的采集时间为主成分峰保留时间的4倍,实际操作时发现等度洗脱的流动相不仅不能使杂质峰与主峰有效分离,且在主成分峰保留时间约5倍处仍有较大杂质峰。本文有关物质采用梯度洗脱程序[2],不仅能使杂质峰与主峰分离效果好且均能检出各杂质峰。

  3.2 对本品有关物质的专属性试验

  结果可知,供试品经上述高温、高湿、酸、碱、光照和氧化破坏后的降解产物与主峰均能达到较好的分离,同时对本品的辅料进行测定,结果也表明辅料对主峰不形成干扰,主峰与相邻杂质峰的分离度均符合要求。综上所述,本法能够准确的用来进行含量及有关物质的测定,具有专属性强、无干扰、分析快速准确的特点。

  3.3 与同批次的葛根素原料药相比

  制剂中有关物质含量均有明显的增加,推测增加的有关物质可能是在制剂制备过程中产生的[3,4],对其有关物质的结构和种类有待进一步考察。

【参考文献】
   1 中华人民共和国药典(二部),2005:689.

  2 中华人民共和国药典(二部),2010:925.

  3 张璐,陈民辉,蔡美明,等.HPLC和LC-MSn分析葛根素及其注射剂中的有关物质.中国生化药物杂志,2008,29(6):361 -365.

  4 徐向辉.对临床使用葛根素注射液出现不良反应的分析.上海中医药杂志,2006,40(8):71-72.

  


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