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创伤弧菌致病性研究进展

来源:INTERNET 作者:余平安(综述) 周丽萍(审校) 2005-6-3
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摘要: 1 致病性 Vv产生的CPS是其毒力必需因子,不但能够使Vv逃避补体介导的溶细胞作用和吞噬细胞的吞噬作用,而且能直接刺激外周血单核细胞释放TNF-α和前炎症细胞因子。CPS诱导产生的抗体无论是在主动保护还是被动保护的动物模型中都能抵抗Vv的攻击。实验 [1] 用Vv有CPS毒力株和无CPS毒力株3。0×10 6 CFU腹腔注射攻击小鼠,......


  1 荚膜多糖
   
  1.1 致病性 Vv产生的CPS是其毒力必需因子,不但能够使Vv逃避补体介导的溶细胞作用和吞噬细胞的吞噬作用,而且能直接刺激外周血单核细胞释放TNF-α和前炎症细胞因子。CPS诱导产生的抗体无论是在主动保护还是被动保护的动物模型中都能抵抗Vv的攻击。实验 [1]  用Vv有CPS毒力株和无CPS毒力株3.0~4.0×10 6 CFU腹腔注射攻击小鼠,2h后CPS组83%动物血清中能检测到TNF-α,无CPS组仅为50%,并且3h后小鼠体内Vv被清除,血清中检测不到TNF-α而CPS组6h TNF-α达高峰,6~9h下降后,在12h又达到另一峰值,其浓度与动物血液中Vv增殖相一致。纯化的CPS比同质量LPS对小鼠诱导TNF-α产生更快。外周血单核细胞实验显示:CPS和LPS对TNF-α的诱导都呈剂量依赖式,高峰段在6~10h,不为多粘菌素B所抑制,并同时诱导IL-6mRNA的表达。
   
  1.2 荚膜多糖和疫苗 Devi等 [2]  以纯化的Vv荚膜多糖(VvPS)和灭活的细胞溶素。蛋白酶通过羧基连接破伤风类毒素(TT)分别合成VvPS-TTa、VvPS-cytolysin和VvPS-eˉlastase,以羟基连接VvPS和TT合成VvPS-TTb。所有连接物皮下免疫小鼠后都能产生抗CPS的IgG、IgM。通过羧基连接的VvPS-TTa、VvPS-cytolysin、VvPS-elastase的免疫原性比通过羟基连接的VvPS-TTb更显著。以5LD 50  (1.8×10 7 CFU)的Vv腹腔内攻击小鼠,VvPS-TTa、VvPS-cytolysin和VvPS-elastase的76h保护率分别为80%、44%、40%;VvPS-TTb的保护率仅为22%;Elastase对照组病死率为70%;而VvPS、cytolysin对照组均100%死亡。提示VvPS-蛋白质联合疫苗预防Vv感染是有保护作用的。进一步研究表明VvPS-TTa、VvPS-TTb和Ribi佐剂或弗氏佐剂一起使用可以明显增强小鼠的免疫反应,产生高滴度的多克隆抗血清,采用抗血清在同型Vv攻击前24h预注射,能够显著提高小鼠的存活率。在小鼠致死性攻击2h后症状明显时,采用抗血清治疗也非常有效,存活率达到60%~73%。这种抗血清保护效果具有型特异性,Ⅰ型和Ⅱ型之间不存在交叉保护。
    
  1.3 分子生物学研究 Zuppardo等 [3]  在Vv临床分离株的基因组中插入转座子,产生无CPS突变株,并从其基因组中分离并克隆出含有转座子及其两侧含有Vv的相应基因区。把这个基因导入无CPS的突变株基因组中,能使其恢复CPS和毒力。TnphoA是一个缺乏促进子和信号序列的碱性磷酸酶基因,和其他基因融合后才能产生碱性磷酸酶。利用TnphoA转座子突变确定了CPS基因区,包括上游的一个操纵子元件,一个wza基因,几个CPS生物合成基因开放读码框(ORF)。同时,环境分离株的调查也阐明了wza的缺失和毒力丢失的关系,和CPS位相变异的遗传学机制。Smith [4]  进一步利用Vv毒力株无CPS转座子突变确定了有4个基因区为VvCPS的表达所必需的,其中3个被确认为在一条染色体片断上,负责CPS的生物合成、聚合和转运。第4个基因区包含CPS表达的一个重要基因,是插入子基因盒区。在染色体的远离CPS基因区的基因位点还不能确实是否为CPS基因的一部分,是由未知功能的正向重复序列组成,这一基因区还包括IS492(在整个基因组可以多次重复出现的插入序列),展示了有CPS和无CPS的Vv限制片断长度多态性。
 
  2 细胞溶素
   
  2.1 致病性 Vv细胞溶素是一种分子量为51,000的水溶性多肽,等电点为7.1,热不稳定性,具有胶体渗透性。结合到靶细胞膜上后,寡聚形成Ca 2+  不能渗透的小孔,次微克量即可对小鼠致死。它能破坏杆状细胞,释放组胺,导致低血压、心动过速、皮肤和肺的损伤。Vv细胞溶素能够导致肠壁的明显破坏,使Vv能够穿过完整的肠壁到达血流引起败血症。在体外,细胞溶素能够诱导人类血管内皮细胞ECV304超氧负离子浓度的升高,引发细胞色素C的释放,激活caspase-3引发细胞凋亡。细胞溶素能溶解红细胞,使之释放出血红蛋白,和蛋白酶共同作用,利用宿主体内的结合铁。韩国学者 [5,6]  研究Vv细胞溶素对CPAE细胞(一种肺内皮细胞)溶解机制中发现,1.0单位细胞溶素能杀死80%的CPAE细胞,死亡的细胞膜上形成跨膜小孔,单价离子可以通过小孔快速流动。0.25单位细胞溶素可以使细胞内ATP水平下降30%。胆固醇可以抑制细胞溶素对CPAE细胞的溶解作用,提示CPAE细胞膜上的胆固醇可能是细胞溶素的结合位点,Vv细胞溶素对哺乳动物细胞膜有高度亲和力,对红细胞、中性粒细胞、杆状细胞、内皮细胞和巨噬细胞等具有广泛的溶解力。Vv细胞溶素通过细胞内信号分子H2 O 2 和NO诱导哺乳动物细胞的活化,表明Vv细胞溶素扮演配体角色,激活细胞内信号系统。7-脱氢胆固醇能够呈剂量依赖式阻断Vv细胞溶素的溶血作用,通过诱导Vv细胞溶素寡聚而灭活,细胞溶素的寡聚完全依赖于胆固醇的三维空间结构。所有这些表明细胞膜是上的胆固醇可能就是细胞溶素在靶细胞上的受体。
   
  2.2 分子生物学研究 Bang等 [7]  发现葡萄糖能够抑制Vv细胞溶素产生。把细胞溶素基因vvh的调节元件和luxCDˉABE基因(无促进子)的融合,在大肠艾希氏菌中的表达评估cAMP及其受体蛋白(CRP)对vvh的影响,发现增加外源性cAMP可以增加细胞溶素的分泌量。而crp的突变却检测不出溶血素,从而揭示vvh受cAMP-CRP调节。细胞溶素基因包含2个片段vvhA和vvhB,vvhA编码细胞溶素,其基因结构与霍乱弧菌El的溶血素基因具有高度同源,vvhB产物还不清楚。Choi等 [8]  报道这2个基因是以一个转录单元转录的,并受单一促进子Pvvh调节,而Pvvh活性是通过CRP直接结合到vvhBA上游CRP结合位点正向调节的。crp的突变使Pvvh活性减弱,vvhBA转录水平降低,细胞溶素分泌量仅为亲株的1/30。

  3 蛋白酶
   
  3.1 致病性 Vv蛋白酶是609个氨基酸残基组成的分子量为45KD、等电点为5.8的蛋白质,对热、pH、重金属盐等敏感。由2个功能区组成,一个N-末端的35KD多肽,是蛋白酶活性区,而C-末端的10KD多肽是底物连接区。Miyoshi等 [9]  以纯化的蛋白酶注射入豚鼠背部引起广泛的皮下出血、水肿,其主要机制为蛋白酶降解血管内皮基底膜的IV胶原纤维,导致血管壁变薄、破裂而致出血。Jeong等 [10]  构建蛋白酶缺失突变株并攻击小鼠,发现对皮下组织、肝脏系统的破坏力都没有受到影响,也没有影响到对上皮细胞INT407的溶解能力,认为蛋白酶在Vv致病过程中的作用并不重要,这是因为Vv产生多种毒力因子,单独蛋白酶的缺失可能被其它毒力因子所弥补。台湾学者 [11]  采用等位基因交换技术产生蛋白酶缺失突变株(protease-deˉficient,PD),发现PD通过腹腔攻击小鼠时,其毒力和亲株无明显区别,而经口攻击时,其毒力反而是亲株的10倍多。PD株液体培养上清液中的细胞溶素浓度比野生株高出两倍多,这可能与经口感染时PD株毒力增强有关。
   
  3.2 分子生物学研究 Vv蛋白酶基因表达高峰在对数生长末期 [12]  ,其表达受LuxR同簇体SmcR的调节,它不但正调节蛋白酶基因,而且还可能负调节细胞溶素基因,因为SmcR的突变导致蛋白酶缺失的同时细胞溶素表达水平显著升高。研究 [13]  表明调节是在转录水平,其转录引物从2个不同位点开始延伸,形成2个促进子PL和PS,PL的活性较PS低,在对数生长期和稳定期都能持续保持活性,不受crp或rpoS(产物为σ因子s)突变的影响,PS的转录只出现在稳定期,并且依赖于rpoS,crp的突变减少PS的活性,crp的灭活并不影响rpoS突变株的PS活性,crp需要通过rpoS执行其调节效果。H lsmann等 [14]  构建的rpoS突变株在各种环境压力下的生存能力减弱,包括对双氧水,高渗透压和酸的抵抗能力。多种蛋白酶活性缺失或降低,表明rpoS对于Vv适应环境变化很重要。

  4 铁载体
   
  4.1 致病性 铁是大多数细菌生长必需元素,Vv毒力分离株合成铁载体,能竞争性结合细胞内的结合铁,形成复合物,再通过Vv表面的铁载体受体,转运到菌体内部利用。无毒分离株不能产生铁载体,所以不能有效利用宿主及环境中的铁源,其生长繁殖缓慢。在Vv致病性方面,铁的利用显得特别重要。铁过载是比免疫损伤对Vv感染更有意义的风险因素。Vv原发性败血症通常与铁过载疾病相关。
   
  在Vv的致病性研究的实验中,常用右旋糖酐铁预注射的小 鼠作为动物模型,增加对Vv的易感性。
   
  4.2 分子生物学研究 Webster等 [15]  采用TnphoA插入突变产生不能利用转铁蛋白的Vv,发现其铁载体合成障碍,致使对乳鼠毒力减低。插入位点于ORFvenB,其产物与铁载体的合成密切相关。许多铁调节基因的表达能够被一种铁结合抑制蛋白Fur(ferric uptake regulation)所抑制。fur缺失突变导致72KD和77KD的两种铁调节外膜蛋白缺失表达,77KD的铁调节蛋白基因已经克隆出,其纯化产物前15个氨基酸残基与霍乱弧菌的亚铁血红素受体(HutA)具有67%的同源性。Vv的亚铁血红素受体(HupA)基因是一个编码712个氨基酸残基的ORF。hupA等位交换,导致77KD蛋白质的表达缺失,不能以血红素或亚铁血红素作为铁源。HupA促进子在转录水平受铁浓度的有力调节。从Vv纯化分离的72KD铁调节外膜蛋白N-末端氨基酸序列与HutA成熟蛋白前15个氨基酸有53%的同源性,HupA突变导致72KD蛋白质表达缺失,不能利用转铁蛋白或铁载体作为铁源。导入含有完整HupA及342bp的上游序列,能够恢复对转铁蛋白或铁载体的利用能力。最近研究 [16]  揭示,RpoS和Fur分别是Vv在稳定生长期和低铁环境下生存起重要作用的转录调节子。在确定RpoS对fur基因的调节同时,发现Fur也是RpoS的调节子成员,尤其是Fur的表达在RpoS突变株中严重受损,提示RpoS与Fur合成有关。fur表达调节是RpoS和Fur相互作用网络调节。
   
  5 结语

  Vv的致病物质是多样的,除上述的以外,还有磷脂酶、IV型链肽酶和脂多糖。其中任何一种物质毒性都是非常强烈的,而它们之间又协同作用,导致快速疾病进程和高死亡率。CPS和LPS诱发宿主机体产生TNF-α、IL-1等内源性热源质作用于体温调节中枢,引起发热。尤其是TNF-α和IL-1β、IL-6、IL-8等前炎症细胞因子的瀑布级联放大作用,引起宿主细胞、组织坏死,最终多器官衰竭死亡。随着分子生物学技术的发展,对Vv致病性研究不断深入到基因表达、调控水平,整个Vv基因组测序工作已完成,对每个基因的功能也正在研究之中。同时,许多学者正在研究宿主机体和Vv致病物质之间的相互作用,包括败血症过程中的各种前炎症细胞因子的动态变化以及它们之间的相互调节关系,并以此为基础探讨Vv感染的预防和治疗。

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  作者单位:325003浙江省温州医学院 


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