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人碱性成纤维细胞生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析

来源:INTERNET 作者:祁雅慧 王雅梅 孙丽翠 闫豫东 司杨 张静宜 邴国英 2005-5-25
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摘要: 【摘要】 目的 研究bFGF对缺血组织血管新生侧支循环形成的作用。方法 采用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增得到人bFGF cDNA,利用基因重组技术将该基因片段重组与pcDNA3。1(+)真核表达载体上,构建成pcDNA/b。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。...


  【摘要】 目的 研究bFGF对缺血组织血管新生侧支循环形成的作用。方法 采用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增得到人bFGF cDNA,利用基因重组技术将该基因片段重组与pcDNA3.1(+)真核表达载体上,构建成pcDNA/b。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。结果 重组质粒转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖。进一步将重组质粒通过脂质体介导,体外转染至人肾细胞293细胞系进行表达,经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆。结论 表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血
管生成活性。

  关键词 碱性成纤维细胞生长因子 基因克隆 基因放大 基因表达 

  of human basic fibroblast growth factor  

  Qi Yahui,Wang Yamei,Sun Licui,et al.
 
    Experiment Center,Capital University of Medical Sciences,Beijing100054.

    【Abstract】 Objective To study the bFGF’s effect on the newly formed vascular bypass of ischemic tissue.Methods The human basic fibroblast growth factor(bFGF)cDNA was amplified by RT-PCR from human tonsil tissue,after DNA sequenced,the bFGF cDNAwas inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+).The reˉcombinant plasmid pcDNA/b was transferred into HUVEC cells mediated by liposome.The transient expression of bFGF was detected by MTT,the results showed that bFGF protein was expressed in HUVEC cells72h after gene transfer.Results It had
 good biological activity to stimulate HUVEC proliferation.The recombinant plasmid pcDNA/b was transferred into293cells mediated by liposome,The positive cells stably expressing of bFGF gene was selected by G418.Conclusion Chick charioallantoic membrane(CAM)bioassay showed that recombinant protein has biologiˉcal activity of hbFGF.

    Key words basic fibroblast growth factor gene clone gene amplification gene expression  

  碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种具有多种生物学活性的细胞因子,它对中胚层及神经外胚层来源的细胞包括成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等都具有明显的促分裂增殖作用 [1]  。在众多已发现的诱导血管生成因子中,bFGF被认为是血管生成因子的重要成员。近年来,应用bFGF基因治疗缺血性心脏病及其他组织缺血性疾病的研究成为热点 [2]  。为了深入研究bFGF对缺血组织血管新生、侧支循环形成的作用,我们进行了bFGF cDNA基因的克隆及其真核表达载体的构建,并对其生物学活性进行了研究,观察了重组质粒转染后对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖作用。进一步将重组质粒通过脂质体介导,体外转染至人肾细胞293细胞系进行表达,用G418筛选稳定表达的重组质粒细胞克隆,并通过鸡胚绒毛尿囊膜试验检测表达产物的促血管生成活性。

  1 材料与方法

  1.1 材料

    1.1.1 菌种、细胞株及质粒 大肠杆菌DH5α为本室保存。 人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)购自北京清源生物公司。质粒pcDNA3.1(+)、pCR-TOPO载体购自Invitrogen公司。

  1.1.2 酶与化学试剂 TaqDNA聚合酶,T 4 DNA连接酶,限制性内切酶购自Promega公司;TOPO TA Cloning kit购自Inˉvitrogen公司;QIAquick gel Extraction kit,QIAGEN plasmid miˉni/midi kit购自QIAGEN公司;细胞培养基Medium-200购自北京清源生物公司;细胞培养基DMEM,G418,LipofecˉtAMINE  TM  Reagent购自GIBCOBRL公司;胎牛血清购自HyˉClone公司;其它试剂均为国产分析纯。

  1.2 方法

    1.2.1 引物设计与合成 根据人bFGF cDNA基因序列,设计合成一对引物,引物中加入HindIII酶切位点:5′AAG CTT ATG GCA GCC GGG AGC ATC3′;5′AAG CTT TCA GCT CTT AGC AGA CATTGG AAG3′。

    1.2.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 用TRIzol试剂盒提取扁桃体组织总RNA,经AMV逆转录酶进行RT-PCR合成cDNA。扩增参数为:50℃,30min;94℃,30s;68℃,3min,40个循环;72℃延伸8min。

    1.2.3 克隆载体的构建 使用新鲜PCR产物与pCR-TOPO载体连接,连接反应按pCR-TOPO载体使用说明进行,37℃LB琼脂培养基培养,氨苄青霉素及蓝/白筛选,挑白色菌落液体培养扩增,提质粒DNA作酶切鉴定,筛选出正确插入克隆。以通用引物SP6进行基因的DNA序列分析,筛选正确克隆pCR-T-b。

    1.2.4 重组真核表达质粒pcDNA/b的构建 用HindIII酶切克隆的pCR-T-b质粒,琼脂糖凝胶电泳分离,回收纯化目的片段;同时用HindIII酶切pcDNA3.1(+)载体,酶切后去磷酸化,琼脂糖凝胶电泳分离,回收载体片段。用T 4 DNA连接酶将纯化的bFGF基因与pcDNA3.1(+)载体片段连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,制备表达质粒;酶切鉴定筛选重组质粒,筛选出的重组质粒进一步测序鉴定。质粒DNA的制备、片段回收、酶切、连接、转化,参照文献 [3]  进行。

    1.2.5 重组质粒pcDNA/b转染HUVEC细胞 采用脂质体转染法,当HUVEC细胞长至50%~80%的单层后,重组质粒pcDNA/b经GIBCOBRL公司的LipofectAMINE  TM  Reagent介导,转染HUVEC细胞,按GIBCOBRL公司提供的操作程序进行。转染后37℃5%CO 2 条件下培养4h,然后更换完全培养基继续培养,同时设置空白载体pcDNA3.1(+)转染作为对照。

    1.2.6 MTT法检测bFGF活性 重组质粒pcDNA/b转染HUVEC细胞37℃5%CO 2 培养72h后,PBS清洗细胞,每孔加MTT反应液500μl,37℃温育4h,加DMSO500μl使溶解,吸入96孔酶标板中,用酶标仪读取A 570  的值,数据用SPSS10.0统计软件包进行分析。

    1.2.7 统计学方法 数据用均数±标准差表示,用SPSS10.0做t检验,α=0.05为显著性水平。

    1.2.8 重组质粒pcDNA/b转染293细胞 采用脂质体转染法,当293细胞长至50%~80%的单层后,将重组质粒pcDNA/b用GIBCOBRL公司的LipofectAMINE  TM  Reagent转染293细胞,按GIBCOBRL公司提供的操作程序进行。转染后72h用G418进行筛选,同时用未转染的293细胞作阴性对照。

    1.2.9 表达产物的生物活性检测 利用鸡胚绒毛尿囊膜法检测rhbFGF在293细胞中表达产物的生物学活性,实验方法参照文献 [4]  进行。

  2 结果

    2.1 人bFGF基因cDNA的RT-PCR结果 以扁桃体组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增后,PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,在标准核酸分子量500bp附近出现1条特异性扩增条带(图1)。

    2.2 克隆载体的构建与检测 新鲜的PCR扩增产物直接与pCR-TOPO载体连接,并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。pCR-TOPO是一个高拷贝数的克隆载体,可以直接与PCR产物连接,重组克隆可直接通过蓝/白筛选检出。提取pCR-T-b重组质粒,用EcoRI单酶切后得到3.9kb(pCR-TOPO)和488bp(插入片段含酶切位点)两个片段(图2),表明PCR扩增的基因片段已插入pCR-TOPO载体中。以SP6为测序引物,重组质粒pCR-T-b中的插入片段经测序证明与文献报道的人bFGF的基因序列一致。

    2.3 真核表达质粒的构建与鉴定 将测序正确的pCR-T-b质粒和pcDNA3.1(+)载体分别用HindIII酶切,琼脂糖 凝胶电泳回收纯化,经T 4 DNA连接酶连接,转化E.coli DH5α感受态细胞。提取的重组质粒,经HindIII酶切鉴定,得到两条带,一条大约5.4kb条带,另一条474bp左右的条带,与目的基因预期酶切片段相符。我们选择经HindIII酶切鉴定正确的3个重组质粒以T7通用引物测序鉴定,筛选出正向插入的重组质粒,插入的目的基因序列与文献报道相同,表明得到了真核表达质粒pcDNA/b。见图3。

  图1 扁桃体组织RT-PCR结果略
   
    图2 重组质粒pCR-T-b 的酶切分析略
   
    2.4 MTT法检测bFGF活性 MTT检测根据酶标仪读取的各样品组的A 570  值(表1),计算促细胞生长活性,公式为:促生长率(%)=(实验组A 570  -对照组A 570  )/对照组A 570  ×100%与pcDNA3.1(+)空质粒对照组相比,pcDNA/b转染HUVEC细胞后,表达产物能够刺激HUVEC细胞对MTT的摄取,促生长率为10.48%,表明pcDNA/b组表达产物具有天然bFGF的生物学活性。

  图3 重组质粒pcDNA/b 的酶切分析略
   
    2.5 pcDNA/b在293细胞中表达 采用脂质体法将 pcDNA/b转染至293细胞,由于pcDNA3.1(+)带有CMV启动子和新霉素抗性基因Neo  r ,所以在动物细胞中可用G418筛选转染pcDNA/b重组质粒的克隆。转染72h后,用G418(400mg/ml)加压选择抗性细胞克隆,收集细胞培养上清液和细胞裂解液。

    表1 HUVEC细胞转染72hMTT法A 570  值 (略)
    2.6 表达产物的生物活性分析 用pcDNA/b在293细胞中的培养上清液和细胞裂解液,检测bFGF对鸡胚绒毛尿囊膜诱导血管新生的作用,同时以生理盐水,pcDNA3.1(+)空质粒在293细胞中的培养上清液和细胞裂解液为对照。实验结果(图4),显示与生理盐水组和pcDNA3.1(+)空质粒对照组相比,pcDNA/b组的细胞培养上清样品对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的促进作用不明显,而pcDNA/b组的细胞裂解液样品有较明显的促血管生成作用,表明细胞裂解液中有rhbFGF的表达,具有促血管生成的生物学活性。

  图4 rhbFGF诱导鸡胚绒毛尿囊膜血管新生略

  
    3 讨论

  bFGF是一种具有多种生物学活性的细胞因子,在机体胚胎发育、骨骼形成、血管新生、创伤修复以及肿瘤形成过 程中起着重要的作用。作为血管生成因子的成员,促进血管生成是bFGF重要的生物学功能之一 [5]。bFGF在体内可以趋化血管内膜的各类细胞,并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶、蛋白水解酶等。这些酶类通过促使血管基底膜降解和刺激内膜各类细胞增殖与迁移,诱导血管内皮细胞在胶原基质中形成管腔,并促进神经元与新生血管共同生长 [6]  。因此,bFGF转基因治疗作为一种新的治疗手段,在缺血性心脏病及其他组织缺血性疾病治疗方面的研究倍受关注。

    本实验通过RT-PCR技术从人扁桃体组织中克隆并筛选出bFGF的cDNA,经测序鉴定后,将目的基因克隆到带有CMV启动子和增强子的pcDNA3.1载体上,成功构建了真核表达载体pcDNA/b。我们以阳离子脂质体Lipofecˉtamine介导pcDNA/b转染HUVEC细胞,经MTT检测证实重组质粒转染后,表达产物能够刺激HUVEC细胞增殖,具有bFGF的生物学活性。进一步将重组质粒通过脂质体介导,体外转染至人肾293细胞系进行表达,经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆,表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。本研究证明,我们构建的bFGF真核表达载体在人血管内皮细胞以及人肾细胞293细胞系中均能正确表达,且表达产物具有较高的生物学活 性,为利用bFGF转基因治疗肢体及心肌缺血性疾病的研究奠定了实验基础。

  参考文献

    1 Inoue K,Sakai T,Hattoori M.The cell-adhesive effect of basic fibrobˉlast growth factor on pituitary cells in vitro.J Endocrinol,1991,130(3):381-386.

    2 Giacia-Martinez C,Opolon P,Trochon V,et al.Angiogenesis induced in muscle by a recombinant adenovirus expressing functional isoforms of basic fibroblast growth factor.Gene Ther,1999,6(7):1210-1221.

  3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社,1995:34-57.

    4 姜志钢,鄂征.鸡胚绒毛尿囊膜检测肿瘤促血管生长作用改良技术方法.解剖学杂志,1989,12(2):143-145.

    5 王雅梅.血管生成因子研究进展.生物技术,2002,12(3):48-50.

    6 郭庆,温进坤.碱性成纤维细胞生长因子.生命科学,1997,9(2):15-18. 

  基金项目:北京市科委科技合同项目(编号:954024800)

    作者单位:100054北京首都医科大学实验中心


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