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双试剂苦味酸法测定血清肌酐的改进

来源:《中华现代临床医学杂志》 作者:郭洪晨 2008-6-30
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摘要: 【摘要】 目的 消除胆红素对碱性苦味酸法测定肌酐的负干扰。方法 用双液体试剂中的RI液和标本进行反应,使胆红素氧化成胆绿素,再进行肌酐的测定,并与原法做对比。结论 双液体两步法消除了胆红素对肌酐测定的干扰。 【关键词】 肌酐 胆红素 苦味酸速率法 Improvement of method of double-reagen......


【摘要】  目的 消除胆红素对碱性苦味酸法测定肌酐的负干扰。方法 用双液体试剂中的RI液和标本进行反应,使胆红素氧化成胆绿素,再进行肌酐的测定,并与原法做对比。结果 原法受胆红素的干扰,本法可有效消除胆红素的影响。结论 双液体两步法消除了胆红素对肌酐测定的干扰。此方法操作简单,结果可靠,经济实用,适合推广。

【关键词】  肌酐 胆红素 苦味酸速率法

    Improvement of method of double-reagent with picric acid for determination of serum creatinine

    GUO Hong-chen.Department of Laboratory,Hepatopathy Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shijiazhuang 050800,China

    [Abstract]  Objective  To minimize bilirubin interference on determination of serum creatinine.Methods  Serum creatinine(Cr) was determined after coversion between bilirubin and biliverdin in the reaction of RI reagent with blood sample,and correlation was done with the Kinetic Jaffe’s method .Results   The double-reagent method could minimize bilirubin interference in plasma creatinine assays,and the main interference in using Kinetic Jaffe’s method for the determination of creatinine was bilirubin.Conclusion  The double-reagent method can minimize bilirubin interference in plasma creatinine assays and is practical,reliable,hence it worths generalizing.

    [Key words]  creatinine;bilirubin;kinetic Jaffe’s method

    碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应形成一种红色复合物,通常在510 nm处根据测定一定时间(20~80 s)内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510 nm处也有较强光吸收,并且在氢氧化钠的作用下,逐渐转化为620nm处有强光吸收的胆绿素,而胆绿素在520 nm处只有很弱的光吸收,这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现,从而使测定结果偏低,甚至出现负值[1]。

    经过查阅有关文献和多次实验,发现胆红素在37 ℃和强碱环境下被氧化成胆绿素[2],导致510 nm处吸光度减少的时间为两者混合后50 s以内,50 s以后510 nm吸光度下降缓慢或基本不变。我们根据这一发现并结合BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪的特点,将原来的双液体试剂反应步骤进行了改进,把原来的一步法改为两步法(以下原方法和改良方法简称为一步法和两步法)。这种改进后的方法可以有效地消除胆红素对肌酐测定的负影响。

    1  材料与方法

    1.1  试剂  碱性苦味酸试剂(试剂R1:300 mmol/L氢氧化钠;试剂R2:20 mmol/L苦味酸)由上海丰汇医学科技公司提供。肌酐标准液、高、中、低定值质控血清:美国进口。仪器:BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪。

    1.2  方法  (1)20 μl血清(TBIL:408 μmol/L)与200 μl试剂R1(300 mmol/L氢氧化钠)混合后,连续检测该混合物分别在520 nm和620 nm处吸光度的变化。结果发现48 s以后520 nm吸光度下降缓慢或基本不变,而620 nm处吸光度在32 s后上升缓慢或基本不变。胆红素被氧化成胆绿素的反应主要发生在标本和RI液混合后50 s以内。(2)根据上述发现并结合BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪的特点,调整后的反应参数。20 μl血清与200 μl试剂R1(300 mmol/L氢氧化钠)反应16 s后加入50 μl试剂R2(20 mmol/L苦味酸),在试剂R2加入后16 s读取起始吸光度(A1),再过48s读取终末吸光度(A2),计算时用A2-A1=ΔA,肌酐的含量为:肌酐(μmol/L)=样品ΔA/标准ΔA×标准浓度(μmol/L)。主波长520 nm,副波长560 nm,反应温度37 ℃。

    2  结果

    2.1  两种方法的比较  选取胆红素和肌酐正常参考值范围的低值定值质控血清(TBIL 10.7 μmol/L、CREA 46 μmol/L),分别用一步法和两步法在BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪各连续测定测定肌酐浓度20次,一步法测定结果:x=45.8 μmol/L,s=2.231,CV=4.9%;两步法测定结果x=47.0 μmol/L,s=2.066,CV=4.4%。经配对t检验,t=1.9880.05,两者无明显差异,并且二者测定结果都接近靶值。

    再取一定量的高值定值质控血清(TBIL 150 μmol/L,CREA 645 μmol/L),在BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪分别用一步法和两步法连续测定肌酐20天。一步法测定结果由于受胆红素的影响,肌酐浓度明显降低(x=625.6 μmol/L,n=20,s=7.39,CV=1.18%)。而两步法胆红素对其影响不大与质控血清肌酐定值接近(x=643.8 μmol/L,n=20,s=5.41,CV=0.84%)。配对t检验,t=8.37>t(0.05,38)(2.024),P<0.05,两者有明显差异。

    2.2  方法的精确性  本方法低(TBIL 13 μmol/L,CREA 119 μmol/L)、中(TBIL 70 μmol/L,CREA 348 μmol/L)、高(TBIL 150 μmol/L,CREA 645 μmol/L)三种质控血清批内变异系数(CV)依次为4.8%(n=20,x=119.4 μmol/L,s=3.51)、2.94%(n=20,x=349.2μmol/L,s=6.92)、0.84%(n=20,x=643.8 μmol/L,s=5.41),批间CV依次为3.79%(n=20,x=120.8μmol/L,s=4.59)、2.06%(n=20,x=350.1μmol/L,s=7.2)、1.52%(n=20,x=640.1μmol/L,s=9.72),精密度良好。

    2.3  回收实验  取3份胆红素在117 μmol/L的血清做试验,分别加入肌酐的浓度为40.9 μmol/L、20.3 μmol/L、10.6 μmol/L做肌酐测定回收试验,测得回收浓度分别为38.9 μmol/L、19.3 μmol/L、10.7 μmol/L回收率依次为95.1%、95.2%、103.8%。

    3  讨论

    苦味酸速率法测定肌酐时,受高胆红素负干扰而致结果明显偏低,甚至出现负值。常用消除干扰方法有强碱法、表面活性剂法、氧化剂法、胆红素氧化酶法、补偿修饰、在部分机型上应用速率B法[3]。预处理法由于添加了其他成分,操作不可避免地显得冗长、繁琐,另一方面因为附加成分的介入,破坏了原有反应体系,可能又会引起新的干扰。速率B法对仪器要求高而难以普及应用。而酶法测定肌酐由于价格的关系,目前只被国内少数医院接受,难以普及。本方法没有添加任何成分,原有的反应体系没有改变,所以方法学评价和原方法一致,并且可以有效地消除胆红素对肌酐测定的干扰,对胆红素>400 μmol/L的标本用生理盐水稀释1倍进行测试效果较好。该方法简单、方便、准确,适合临床推广。

【参考文献】
  1 鄢斌.消除胆红素对肌酐测定的干扰.实用医技杂志,2007,6(3):308-309.

2 顾新民.碱性苦味酸测定肌酐影响的因素.中华现代中西医杂志,2005,4(3):356-357.

3 石凌波.消除胆红素对肌酐测定的负干扰.国外医学·临床生物化学与检验学分册,1999,20(1):6-8.

(编辑:丁 林)


作者单位:050800 河北石家庄,河北中医肝病医院检验科


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