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酶标法FSH、HCG及PRL检测药盒的研制

来源:中华现代临床医学杂志 作者:门晓文 张洪雁 董春娥 刘素文 张海涛 李继峰 李丽梅 单秀娟 孟召祥 2005-9-22
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摘要: 【摘要】 目的 采用酶标记方法进行人卵泡刺激素(FSH)、绒毛膜促性腺激素(HCG)及催乳素(PRL)检测药盒的研制。 方法 采取抗人FSH、PRL及HCG单克隆抗体,同生物素/亲和素酶联免疫系统相结合,制备检测人血清FSH、PRL及HCG激素水平的ABC-ELISA检测药盒。关键词 卵泡刺激素 催乳素 绒毛膜促性腺激素 ABC-ELISA检测药盒卵......


  【摘要】 目的  采用酶标记方法进行人卵泡刺激素(FSH)、绒毛膜促性腺激素(HCG)及催乳素(PRL)检测药盒的研制。 方法  采取抗人FSH、PRL及HCG单克隆抗体,同生物素/亲和素酶联免疫系统相结合,制备检测人血清FSH、PRL及HCG激素水平的ABC-ELISA检测药盒。 结论  灵敏度较常规的ELISA法提高了4~80倍,和同位素法(RIA)相比较差异无显著性。 结果  本试剂盒具有灵敏度高、对环境无污染等优点。

  关键词  卵泡刺激素 催乳素 绒毛膜促性腺激素 ABC-ELISA检测药盒

  卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、催乳素(prolactin,PRL)及绒毛膜促性腺激素(human chorionic go-nadotropin,HCG)是人体中重要的内分泌激素。内分泌功能障碍,可导致人体多种疾病的发生,因此准确的检测体内激素水平对诊断内分泌疾病有着重要意义。目前临床上广泛使用的检测手段为同位素法(radioimmunoassay,RIA),该方法具有灵敏度高、重复性好等优点,但仍存在需要昂贵的仪器、培养专业人员及对环境污染等问题。本实验室利用生物素/亲和素系统(Biotin-Avidin)标记单克隆抗体,制备了ABC-ELISA检测药盒,并与RIA法进行了比较性观察。

  1 材料与方法

  1.1 材料 FSH、PRL、HCG标准品购自SIGMA公司,单克隆抗体由本室制备,羟基琥珀酰亚胺脂生物素、亲和素-RP购自华美生物公司,常用生化试剂均购自本地。

  1.2 方法

  1.2.1 单克隆抗体的制备 本室采用的是脾免疫法制备单克隆抗体(McAb) [1] 。免疫动物为BALB/c小鼠。将抗原溶于生理盐水中,配制浓度为1μg/μl。乙醚麻醉小鼠,皮肤消毒后,打开腹腔暴露脾脏,在脾内注入4μl抗原,观察无活动性出血后关腹。于免疫的第3天眼球后取血,做免疫扩散实验,效价在64倍以上。摘除小鼠眼球放血,收集分离血清保存备用。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆筛选出阳性细胞3株,亚单位分型IgG2株,IgM1株。将阳性细胞株分别注射到小鼠腹腔内扩大培养,并收集腹水,经A蛋白柱提取IgG,利用ELISA法测定效价,均可达1∶6400倍以上。

  1.2.2 抗体的生物素化 (1)取羟基琥珀亚胺脂生物素40mg溶解于二甲基甲酰胺1ml中;(2)将提纯的单克隆抗体在浓度0.1mol/L、pH8.0、NaHCO 3 溶液中进行透析,蛋白浓度调节到10mg/ml;(3)取抗体1ml加入羟基琥珀亚胺脂生物素储存液50μl中搅拌均匀,室温放置2h;(4)在0.1mol/L、pH7.4的PBS缓冲液中透析过夜,保留抗体;(5)Sephadex G25凝胶过滤去除未结合的生物素;(6)加入等量的甘油,-20℃保存。

    1.2.3 ABC药盒的检测方法 采用的是双抗体夹心法进行检测:(1)混合单克隆抗体1000倍稀释,包被苯乙烯检测板上4℃过夜;(2)0.1MPBS-T(吐温)洗3次,3min/次;(3)每孔加入血清样品100μl37℃保温1h;(4)0.1MPBS-T洗3次,3min/次;(5)0.6%明胶PBS100μl37℃封闭1h;(6)0.1M PBS-T洗3次,3min/次;(7)加入生物素标记的抗体100μl37℃保温1h;(8)0.1M PBS-T洗3次,3min/次;(9)加入亲和素-HRP100μl37℃保温1h;(10)0.1M PBS-T洗3次,3min/次;(11)POD显色10min,用0.2M H 2 SO 4 终止反应;(12)酶标检测仪490nm处读取数值,采用内插法计算含量。

  2 结果

  通过临床观察250例,FSH100例,PRL100例,HCG50例。采取同一份血清样品,同时采用两种检测方法(RIA法、ABC-ELISA法)做比较。其结果见表1~3、图1~3,两者差异无显著性,P<0.05。

  表1 人FSH血清样品两种检测方法的比较 (略)

   
  图1 人FSH血清样品两种检测方法的比较

  表2 人PRL血清样品两种检测方法的比较 (略)

  图2 人PRL血清样品两种检测方法的比较

  表3 人HCG血清样品两种检测方法的比较 (略)
   
  图3 人HCG血清样品两种检测方法的比较

  3 讨论

  近年来国外已有多篇报道,将高亲和力的生物素/亲和素系统同常规的ELISA方法相结合,在敏感性、特异性及快速性上都取得了较满意的结果。生物素/亲和素系统用于ELISA一般有三种形式,即桥联法(BAB)、标记法(BA)和ABC法,不少学者用之检测了不同的抗原—抗体系统均取得了较好的结果,其中以BA法和ABC法应用较多,敏感性一般比常规ELISA法高4~80倍。本实验室采用的是ABC法,将生物素直接标记在Ⅰ抗上,标记方法简单 [2] ,易掌握,生物素与抗体结合牢固。抗原~Bio-IGg~Avi-HRP直接检测方法,减少了Ⅱ抗这一中间环节,也就减少了一个非特异结合的因素。在原来的ELISA方法上加生物素/亲和素系统的放大效应使灵敏度提高一个百分点,检测水平接近RIA法,克服了同位素对环境的污染及需要昂贵的仪器设备等缺点,为尽早实现“绿色世界”计划、保护自然环境提供了一个好的检测方法。

  参考文献

  1 张洪雁.应用脾免疫法制备HCG单克隆抗体.中国生物制品学杂志,1996,6:1.

    2 程云.生物素—抗生物素标记蛋白的制备及BA—ELISA建立和初步应用的研究.第四军医大学学报,1987,8(2):80-85.

  (编辑建 伟)

  作者单位:130041吉林省计划生育科研所 


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