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几种皮肤美白剂功效的比较

来源:中华现代临床医学杂志 作者:杨龙海尹鸿萍薄并宏 2005-9-22
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摘要: 【摘要】 目的 通过综合比较各种美白剂对胞内、胞外酪氨酸酶活性的抑制率以及对细胞毒性的大小,筛选出最佳美白剂。同时利用方法学研究,建立一套简便、有效的皮肤美白剂筛选方案。方法 利用酪氨酸酶催化底物L-DOPA生成黑色素,通过吸光度法测定比较几种美白剂在胞内、胞外对酪氨酸酶活性的抑制率,利用MTT法测定美白剂对......


   【摘要】 目的 通过综合比较各种美白剂对胞内、胞外酪氨酸酶活性的抑制率以及对细胞毒性的大小,筛选出最佳美白剂。同时利用方法学研究,建立一套简便、有效的皮肤美白剂筛选方案。方法 利用酪氨酸酶催化底物L-DOPA生成黑色素,通过吸光度法测定比较几种美白剂在胞内、胞外对酪氨酸酶活性的抑制率,利用MTT法测定美白剂对细胞毒性的大小,绘制出各种美白剂浓度与其酪氨酸酶抑制率关系曲线,得到各美白剂的ICmax及IC 50  ,通过比较其大小,来确定各美白剂效果的优劣。结果 胞外酪氨酸酶活抑制实验表明:美白剂对酪氨酸酶最高抑制率大小为:熊果苷>Vc针剂>曲酸>氢醌>Vc-Na,最大抑制浓度排序为:Vc-Na>熊果苷>曲酸=氢醌>Vc针剂,半数抑制浓度排序为:Vc-Na>熊果苷>氢醌>曲酸>Vc针剂;胞内酪氨酸酶活抑制实验表明:各美白剂在胞内对酪氨酸酶半数抑制率浓度大小为:Vc-Na>熊果苷>曲酸>Vc针剂。结论 熊果苷美白效果较好,细胞毒性相对小,性质稳定,是目前应用最为广泛的美白剂。

  皮肤美白剂是通过作用于皮肤黑素的形成、代谢途径的某个阶段,能够显著控制、抑制黑素生成且符合安全要求的物质。皮肤黑素生成的过程主要在黑素细胞的特征性细胞器 ———黑素小体内进行的,体内的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴、多巴醌、多巴色素、5,6-二羟吲哚、吲哚-5,6-醌等 [1]  ,最终转变为色素颗粒,其反应过程如下所示。  在酪氨酸反应生成黑素的过程中,酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化成多巴和多巴转化为多巴醌这两个反应中。因此,一大类美白剂的作用是通过抑制酪氨酸酶活性,阻断从酪氨酸生成黑色素的氧化反应 [2]  ,从而减少黑素的生成,达到美白的效果,如熊果苷。有些不仅能阻断黑素生成过程中的酪氨酸酶活性,而且对已生成的黑素具有还原能力,从而达到双重美白效果,如Vc类美白剂。因此,我们此次实验对这两种典型美白剂做了重点研究。

    评价一种皮肤美白剂的优劣,不仅要看其美白效果,还要视其对细胞毒性的大小 [3]  。近年来,国内外开发研制了多种皮肤美白剂,而对其进行筛选的方法却很少报道。我们此次设置了胞外酪氨酸酶活抑制实验,来测定美白剂抑制酶活的能力 [4,5]  ;B 16  黑素细胞瘤的基本结构,特别是黑素合成功能与正常的人皮肤黑素细胞基本一致 [6]  ,所以设置了B 16  胞内酪氨酸酶活抑制实验,模拟美白剂抑制人细胞内酪氨酸酶活的能力;另外加设了MTT实验,以测定美白剂对细胞生长的抑制作用。

    本实验在筛选皮肤美白剂的同时,建立了一套完整、简便的皮肤美白剂筛选方案体系,为今后常规大量分析提供可能。

  1 实验

    1.1 胞外酪氨酸酶活抑制实验

    1.1.1 主要仪器、试剂及药品 721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);电子分析天平;恒温水浴锅。L-多巴(sigma公司);酪氨酸酶(sigma公司25000U);pH6.8磷酸缓冲液;小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。美白剂:熊果苷、Vc-Na、曲酸、氢醌(以上由辛普提供),Vc针剂(江苏宜兴前进制药厂)。

    1.1.2 实验方法 按表1准确吸取1,2,3,4组酪氨酸酶溶液,美白剂溶液,缓冲液于试管,混匀,28℃预热10min,加入L-多巴酪氨酸酶溶液,28℃准确反应5min,迅速转移至比色皿中,于475nm处测吸光度值(A),每组平行实验2次。按下式计算对酪氨酸酶抑制率。抑制率=[1-(A 3 -A 4 )/(A 1 -A 2 )]×100%式中:A 1 ,A 2 ,A 3 ,A 4 分别代为表1中1,2,3,4号反应液于28℃,5min时,475nm处的吸光度。

  表1 反应液组成 (略)   

  对于上述各美白剂样品,每种美白剂均测定其不同浓度下的抑制率,从而得到浓度-抑制率关系曲线。从该曲线求出IC  max  及IC 50  。

    1.2 胞内酪氨酸酶活抑制实验

    1.2.1 主要仪器、试剂及药品 恒温CO 2 培养箱(上海申兴公司);电子分析天平;96孔平底培养板;酶联免疫标志仪;血球计数板;倒置显微镜(上海照相机三厂);胰酶(sigˉma公司);培养液pH6.8磷酸缓冲液;L-多巴(sigma公司);小鼠黑色素瘤细胞(B16)美白剂:熊果苷,Vc-Na,曲酸(以上由辛普提供),Vc针剂(江苏宜兴前进制药厂)。

    1.2.2 主要试剂的配制 胰酶:在100ml pH6.8的磷酸缓冲液中加入0.02g EDTA(EDTA溶液性不好,故先加入,如不溶,可加热至37℃),全溶后加入0.25g,溶解后小滤器过滤至血清瓶4℃保存。1640培养液:1640培养基1包、链霉素100mg、青霉素60mg、NaHCO 3 2.0g溶于1000ml纯净水中,大滤器过滤,4℃保存细胞培养液:90ml1640培养液、小牛血清10ml、谷氨酰氨20mg混匀后小滤器过滤至血清瓶,4℃保存。

    1.2.3 实验方法 (1)细胞复苏:在液氮中冷冻的细胞取 出,迅速放入37℃水中解冻,把解冻液吸入离心管,2500rpm,离心3min。弃上清液,在离心管中加入37℃预热的培养液,小心吹打,使沉降物分散溶解,把混悬液吸入培养瓶中,加入足够培养液,37℃,5%CO 2 培养箱培养。(2)细胞培养在培养箱中进行,每天换液,待生长到布满瓶底后,消化:弃去培养液,加少量胰酶于培养瓶中,荡洗后倒去,加入胰酶消化,在显微镜下看细胞呈圆形,晃动培养瓶有细胞漂起,加入培养液终止消化,转移入离心管中2500rpm,离心3min。弃上液,加入培养液吹打,分瓶培养。(3)多次培养后,待细胞到对数生长期,消化,加入培养液吹打后,血球计数板计数,接种于96孔板,每孔3×10 3 个细胞,每孔加培养液至200μl,空白孔不接种细胞。(4)在培养箱中培养1天,待细胞贴壁后,吸去上层培养液,加入含有不同浓度美白剂的培养液200μl,每个浓度6孔,6个孔中加入200μl不含药培养液做对照组,培养3天,1.5天时换药。(5)3天后,吸去上层培养液,用pH6.8的磷酸缓冲液洗2次,每孔(包括空白和对照)加入1%脱氧胆酸钠135μl,振荡10min,加入1.5%L-多巴15μl,37℃反应30min。以空白孔调零,在490nm处测各孔吸光度值,按公式:IR%=(1-加药组各浓度平均A475/对照组平均A475)×100%计算各浓度下对酪氨酸酶活性的抑制率,从而得到浓度-抑制率关系曲线。从该曲线求出IC  max  及IC 50  。

  2 结果与讨论

     2.1 胞外酪氨酸酶活抑制实验 各美白剂浓度与抑制率关系见表2和图1~5。实验表明,当反应时间一定时,美白剂浓度与其抑制率曲线为钟形线,即抑制率随浓度的增加而增大到最高值后,浓度再增大时,抑制率缓慢降低。

  表2 美白剂各浓度对应的酪氨酸酶抑制率 (略)

  从上面5张图中,我们分别可以求出每种美白剂的IC  max  与IC 50  ,见表3。从表中可以看出,最高抑制率大小为:熊果苷>Vc针剂>曲酸>氢醌>Vc-Na;最大抑制浓度排序为:Vc-Na>熊果苷>曲酸=氢醌>Vc针剂;半数抑制浓度排序为:Vc-Na>熊果苷>氢醌>曲酸>Vc针剂。

  2.2 胞内酪氨酸酶活抑制实验 因氢醌有较强细胞毒性,现已被逐渐淘汰,所以我们在细胞内实验中未对其进行研究。因胞内实验影响因素较多,故重现性较差,且实验周期较长,故测出几个浓度对应的抑制率后,利用回归方程求出IC 50  来比较各美白剂的效果,结果见表4。

  表3 各美白剂对酪氨酸酶的最高抑制率、IC  max  与IC 50  比较 (略)

  表4 各美白剂不同浓度对应的胞内酪氨酸酶抑制率略

  由表4可知各美白剂在胞内对酪氨酸酶半数抑制率浓度大小为:Vc-Na>熊果苷>曲酸>Vc针剂。

     综上,Vc针剂与氢醌对酪氨酸酶活性的抑制率最高,且达到半数抑制的浓度最低,所以美白效果最好。但在实际应用中,由于氢醌有较强的细胞毒性,会造成皮肤永久脱色 [7]  ,现已经被逐渐淘汰。而Vc-Na等Vc衍生物虽然对酪氨酸酶活性抑制率较低,但在人体细胞内可以转化为Vc,发挥美白作用,故美白效果与Vc相当,且更稳定,细胞毒性更小,是优良的皮肤美白剂。熊果苷美白效果较好,细胞毒性相对小,性质稳定,所以是目前应用最为广泛的美白剂。(本文图片略)

  参考文献

    1 Wata M,Corn T,Iwata S,et al.The relationship between tyrosinase acˉtivity and skin color in human foreskins.J Invest dermatol,1990,95:9- 15.

    2 Kazuo Misaki,Shoichiro Ozaki.Design of nover hybrid vitamin C erivaˉtives.biological activity Chem Pharm Bull,1986,44(9):1647-1654.

 3 王白强,曾晓军.酪氨酸酶活性的抑制研究及皮肤美白化妆品的研制.福建轻纺,2002,7(7):2-6.

    4 宋琦如,沈光祖,金锡鹏.几种皮肤美白剂的功效评价.日用化学工业,2002,4(2):47-49.

    5 刘宇红,董银卯,李才广.皮肤化学美白剂抑制酪氨酸酶活性的研究.日用化学工业,2001,2(1):21-23.

    6 宋琦如,沈光祖,金锡鹏.几种美白化学物对皮肤黑素细胞的毒性研究.劳动医学,2001,6(3):160-162.

    7 Jinenez-Cervantes C,Solano F,Kobayashi T.A new enzymatic function in the melanogenic pathway.The5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase activity of tyrosinase-related protein-1(TRPI).J Bio Chem,1994,269(27):17993-18000.

  作者单位:1 210018江苏省南京市玄武区中医院
   
      2 210009中国药科大学微生物教研室 

    


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